[摘要]目的探究鸦胆子结合吡柔比星对膀胱癌细胞的作用。方法选取2023年4—5月期间黑龙江省医院泌尿科1株人BIU-87膀胱癌细胞株为研究对象，细胞培养后，将其接种于96孔板中，以随机数表法分为5组，每组细胞均进行3个平行样本，每个样本细胞均设置5个复孔（每组共计15个样本量），将5组细胞以不同浓度鸦胆子油乳（0、5、10、20、30 mL/L）与吡柔比星（5μmol/L）联合作用，分析不同浓度鸦胆子油乳对膀胱癌细胞增殖抑制作用、细胞凋亡及细胞周期影响，并检测联合用药对核因子κB（Nuclear FactorκB，NF-κB）影响、对细胞中三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）结合转运蛋白G家族成员2（ATP-binding Cassette TransporerG2，ABCG2）表达情况影响。结果鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；鸦胆子油乳浓度为5 mL/L时细胞增殖抑制率、细胞坏死率显著提升，浓度≥10 mL后，细胞凋亡率显著提升，差异有统计学意义（P均＜0.05）；随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞中S期细胞占比降低，C0/C1期细胞占比升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；随鸦胆子油乳浓度升高，细胞质中NF-κB表达量逐渐下降，细胞核中NF-κB表达量逐渐升高，细胞膜表面ABCG2表达量下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论鸦胆子油乳结合吡柔比星，可抑制BIU-87膀胱细胞株增殖，低浓度可促进细胞坏死，高浓度可促进细胞凋亡，并促进NF-κB从细胞质转入细胞核中，抑制ABCG2表达，其效果均存在剂量依赖性。

　　[关键词]膀胱癌；鸦胆子；吡柔比星

　　Effect of Brucea Javanica Combined with Pirarubicin on Bladder Cancer Cells

　　SUN Shiheng,XIA Silong,ZHANG Bo,ZHOU Dahong

　　Department of Urology,Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin,Heilongjiang Province,150036 China

　　[Abstract]Objective To explore the effect of brucea javanica combined with pirarubicin on bladder cancer cells.Methods A human BIU-87 bladder cancer cell line from Department of Urology of Heilongjiang Provincial Hospital during April to May 2023 was selected as the research object.After cell culture,the cell lines were inoculated into 96-well plates and divided into 5 groups by random number table method.Three parallel samples were taken from each group of cells,and five multiple pores were set in each sample(15 samples in total for each group).Five groups of cells were treated with different concentrations of brucea javanica oil emulsion(0,5,10,20,30 mL/L)combined with pi‐rarubicin(5μmol/L).The effects of different concentrations of brucea javanica oil emulsion on proliferation inhibition,apoptosis and cell cycle of bladder cancer cells were analyzed.The effects of combined administration on nuclear fac‐torκB(NF-κB)and the expression of adenosine triphosphate(ATP)combined with ATP-binding cassette transpor‐erG2(ABCG2)in cells were detected.Results The proliferation inhibition rate,necrosis rate and apoptosis rate of BIU-87 cells were increased with the increase of brucea javanica oil emulsion concentration,the difference was statisti‐cally significant(all P＜0.05).The cell proliferation inhibition rate and cell necrosis rate were significantly increased when the concentration of brucea javanica oil was 5 mL/L,and the apoptosis rate was significantly increased when the concentration was greater than 10 mL,the difference was statistically significant(all P＜0.05).The proportion of S phase cells in BIU-87 cells decreased and the proportion of C0/C1 phase cells increased with the increase of the con‐centration of brucea javanica oil emulsion,the difference was statistically significant(all P＜0.05).As the concentration of brucea javanica oil emulsion increases,in the cytoplasm the expression level of NF-κB gradually decreases,in the nucleus the expression level of NF-κB gradually increased,while the expression level of ABCG2 on the cell mem‐brane surface decreased,the difference was statistically significant(all P＜0.05).Conclusion Brucea javanica oil emul‐sion combined with pirarubicin can inhibit the proliferation of BIU-87 bladder cell line,low concentration can pro‐mote cell necrosis,high concentration can promote cell apoptosis,and promote the transfer of NF-κB from cytoplasm to nucleus,and inhibit the expression of ABCG2 in a dose-dependent manner.

　　[Key words]Bladder cancer;Brucea javanica;Pirarubicin

　　膀胱癌为泌尿系常见恶性肿瘤。该病发病原因复杂，一般认为与内在、外在因素共同作用引发有关，以血尿、排尿障碍为主要临床表现[1]。吡柔比星（Pirarubicin）为该病主要抗肿瘤药物[2]。但在用药治疗期间存在肿瘤细胞耐药情况，影响患者病情控制效果，威胁其生命安全。鸦胆子是一种清热解毒药。现代药理研究发现，鸦胆子油乳具有抗炎、杀菌、止痛等作用[3]。有研究发现，在对膀胱癌患者治疗中，通过基因水平靶向调控作用，可提升肿瘤细胞药物敏感性[4]。核因子κB（Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB）为化疗中诱导细胞耐药重要环节，经上游信号通路启动DNA合成，促进细胞增殖，诱导恶性肿瘤进展[5]。腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate,ATP）结合转运蛋白G家族成员2（ATP-binding Cassette Superfamily Gmember 2，ABCG2）为细胞膜表面蛋白，其表达上调可能会增强ATP将药物从细胞内向细胞外转移能力，增加细胞耐药性[6]。为此，选取2023年4—5月期间黑龙江省医院泌尿科1株人BIU-87膀胱癌细胞株为研究对象，分析鸦胆子油乳对膀胱癌细胞增殖、凋亡及耐药情况影响。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　研究所用细胞及主要试剂见表1。本次研究经本院医学伦理委员会审核批准通过（SYYLLBA2022041）。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养及预处理人BIU-87膀胱癌细胞，接种于RPMI-1640培养液中（包含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%胎牛血清），5%CO2、37℃、湿度100%环境培养。取对数生长期细胞，0.15%胰酶+0.1乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tet‐raacetic Acid，EDTA）消化处理制成单细胞悬液；细胞计数，以1×106/L浓度接种培养瓶中继续培养；细胞生长至半融合状态时进行预处理：细胞恒温孵育（水浴，42℃,30 min），移出细胞后培养（5%CO2、37℃、湿度100%）24 h时进行实验。

　　1.2.2分组情况将细胞以5×104个/mL接种于96孔板中，100μL/孔；设置1组空白对照，均添加吡柔比星，浓度为5μmol/L，并分别加入0、5、10、20、30 mL/L浓度鸦胆子油乳，培养24 h时进行实验研究。

　　1.2.3细胞增殖抑制率观察每孔加20μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后终止培养，弃上清，每孔加100μL二巯基丁二酸（Dimercaptosuccinic Acid,DMSA），振荡使晶体溶解后，酶标仪492 nm处读取吸光值（D），计算细胞增殖抑制率（Proliferation Inhibition Rate，IR）；IR=（1-D试验孔/D对照孔）。

　　1.2.4细胞凋亡情况观察使用凋亡检测试剂盒检测。细胞以0.12%胰酶消化，磷酸盐缓冲液（Phos‐phate Buffer Saline，PBS）洗涤2次后，加入200μL结合缓冲液混匀后，加10μL Annexin V-FITC、5μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光染色15 min，应用流式细胞仪检测，利用Cellquest软件分析细胞坏死及凋亡情况，统计记录细胞坏死率、凋亡率。

　　1.2.5细胞周期情况取各组细胞，弃上清，PBS冲洗2次，70%冷乙醇中重悬过夜固定（4℃);检测前离心（离心条件：1 000 r/min，10 min），弃上清，PBS洗涤2次，加25μL 2 mg/mL核糖核酸酶A，37℃下静置30 min，加25μL PI染料，避光染色30 min，经流式细胞仪检测确定细胞周期。

　　1.2.6 NF-кB表达情况以Western印迹法检测NF-кB表达情况，即依据细胞质、细胞核蛋白分离抽提试剂盒说明书进行蛋白质提取。每组蛋白样本定量后，各取30μg进行不连续10%SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭（1 h），加1∶1 000稀释的兔抗人NF-кB/p65多克隆抗体、β-action多克隆抗体（细胞质内参）、1:500稀释的兔抗人TBP多克隆抗体（细胞核内参），4℃过夜。加1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为一抗，室温孵育2 h，加电化学发光试剂，X线胶片曝光并扫描，以Quantity One v4.62凝胶定量软件分析蛋白条灰度值，通过细胞核、细胞质内参统计细胞核、细胞质中NF-кB蛋白相对表达水平，以对照组比值为100%标准化处理后，对各组蛋白表达量半定量分析。

　　1.2.7 ABCG2表达情况以Western印迹法检测ABCG2表达情况。与“1.2.6”中相同方法提取总蛋白后，以二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）法定量40μg样品上样，以SDS-PAGE法分离蛋白质，以5%脱脂奶粉室温封闭（1 h），添加ABCG2一抗，4℃过夜，添加ABCG2二抗孵育1 h，加电化学发光试剂，X线胶片曝光并扫描，以Quantity One v4.62凝胶定量软件分析蛋白条灰度值，以GAPDH为内参，统计细胞膜上ABCG2相对表达水平，蛋白定量方法与“1.2.6相同”。

　　1.3质量控制

　　每组细胞均进行3个平行样本，每个样本细胞均设置5个复孔（每组共计15个样本量）；每个样本重复检测3次，取3次检测结果平均值。

　　1.4统计方法

　　采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率、细胞周期、NF-кB、ABCG2表达为计量资料，符合正态分布，以(±s)表示，行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率影响

　　随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；鸦胆子油乳浓度为5 mL/L时细胞增殖抑制率、细胞坏死率显著提升，浓度≥10 mL后，细胞凋亡率显著提升，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表2。

　　2.2不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞周期影响

　　随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞中S期细胞占比降低，C0/C1期细胞占比升高，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表3。

　　2.3不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞NF-кB、ABCG2表达情况影响

　　随鸦胆子油乳浓度升高，细胞质中NF-κB表达量逐渐下降，细胞核中NF-κB表达量逐渐升高，细胞膜表面ABCG2表达量下降，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表4。

　　3讨论

　　吡柔比星为膀胱癌主要治疗药物，通过将肿瘤细胞停滞在G2细胞期来抑制细胞分裂过程，促进细胞凋亡。在对膀胱癌治疗中，吡柔比星膀胱热灌注治疗可通过其热效应增加与肿瘤细胞接触，以控制膀胱癌进展，降低肿瘤临床分期，且局部灌注治疗可降低化疗药物全身性不良反应，提升治疗安全性[7]。但在应用吡柔比星治疗中，部分患者存在药物治疗敏感性差，或吡柔比星耐药情况，使患者出现病情反复、原位肿瘤控制不理想等情况，影响预后。因此在对膀胱癌患者应用吡柔比星治疗基础上，如何联合用药可提升患者化疗药物敏感性，为目前研究关键。

　　鸦胆子属中药饮片，其中鸦胆子油乳主要成分为油酸及亚油酸[8]。有研究发现，鸦胆子油乳能够抑制肿瘤细胞DNA合成，破坏肿瘤细胞生物膜结构，抑制肿瘤内部血管新生，因此起到抗肿瘤作用[9-10]而将其应用于接受吡柔比星热灌注治疗的膀胱癌患者中，是否可起到协调作用、增强患者对吡柔比星药物敏感性研究较少。本次研究结果显示，与单纯应用吡柔比星（鸦胆子油乳浓度为0时）相比，联合不同浓度鸦胆子油乳，均会增强肿瘤细胞增殖抑制作用，并促进肿瘤细胞坏死及凋亡，分析原因为，鸦胆子苦醇可抑制NRF2基因表达，以抑制肿瘤细胞增殖过程，促进肿瘤细胞凋亡[11]，通过RhoA/RO CK1信号通路抑制肿瘤细胞迁移及侵袭[12]，同时可通过Nrf2/HO-1通路诱导铁死亡，以促进肿瘤细胞凋亡[13]，可能为联合鸦胆子油乳后对肿瘤细胞增殖抑制、促进细胞凋亡影响因素之一。同时在本次研究中发现，低浓度鸦胆子油乳可促进肿瘤细胞损伤，高浓度则促进肿瘤细胞凋亡，而经肿瘤增殖抑制作用中可见，其对肿瘤细胞作用过程存在剂量依赖性。

　　本次研究结果显示，随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞中S期细胞占比降低，C0/C1期细胞占比升高（P均＜0.05），且随鸦胆子油乳浓度升高，细胞质中NF-κB表达量逐渐下降，细胞核中NF-κB表达量逐渐升高（P均＜0.05），考虑原因为，NF-κB是一种控制DNA转录的蛋白质复合物，在机体炎症反应、恶性肿瘤后，其在细胞核中大量合成分泌到细胞质中，用于参与细胞增殖、分化及凋亡，并促进血管新生[14]；联合鸦胆子油乳后，该药本身会造成肿瘤细胞损伤、干扰肿瘤细胞增殖过程，加速吡柔比星经细胞外间质进入细胞内，参与至肿瘤细胞DNA中，抑制细胞增殖分裂过程，将细胞停滞在C0/G1期，抑制细胞核对NF-κB合成作用，进而降低NF-κB从细胞核向细胞质分泌过程，促进细胞对NF-κB稳定分泌能力，降低细胞质中NF-κB水平，并抑制细胞增殖分裂[15-16]。

　　本次研究结果显示，随鸦胆子油乳浓度升高，细胞膜表面ABCG2表达量下降，考虑原因为，ABCG2为细胞膜表面蛋白，其表达水平上调会通过ATP向细胞外排出药物成分；应用鸦胆子油乳后可下调ABCG2表达过程，关闭药物成分经细胞膜排出通道，增强吡柔比星对肿瘤细胞DNA作用能力；而随鸦胆子油乳浓度增加，其对ABCG2表达下调控制能力增强，而经本实验室研究结果得出，miR-144-3p与ABCG2具有直接靶向关系，提示鸦胆子油乳可能对miR-144-3P具有上调作用，使肿瘤细胞对吡柔比星持续表达出高度药物敏感性，可能为该药浓度升高后肿瘤增殖抑制能力增强、损伤凋亡数量增加主要影响因素[17]。付皓云等[18]在其研究中发现，鸦胆子油乳（40 mg/L）可显著抑制食管鳞状癌细胞增殖[（4.48±0.08）%vs（6.61±0.12）%]，促进肿瘤细胞凋亡[（19.60±3.15）%vs（5.37±1.20）%]，与本次研究的[（80.15±7.15）%vs（5.41±1.20）%]、[（19.07±2.44）%vs（3.02±0.45）%]结果一致。但本次研究重点为鸦胆子油对吡柔比星治疗耐药机制影响，可为该病临床方案制订提供更准确参考依据。

　　综上所述，鸦胆子油乳结合吡柔比星，可抑制BIU-87膀胱细胞株增殖，低浓度可促进细胞坏死，高浓度可促进细胞凋亡，并降低细胞质中NF-κB表达量，抑制ABCG2表达，其效果均存在剂量依赖性。

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