【摘要】目的探讨纽约食管鳞状上皮癌抗原1(NY-ESO-1)在原发性肝细胞肝癌(HCC)组织中的表达及其临床意义，以期为临床治疗该疾病提供参考依据。方法回顾性分析2013年1月至2019年12月于安徽医科大学安庆医学中心接受手术治疗的71例HCC患者的临床资料，并搜集其术后石蜡包埋的肝癌组织与癌旁组织标本，分别作为HCC组、癌旁组；同期回顾性分析30例肝血管瘤或肝内胆管结石患者的临床资料，并取其术后石蜡包埋的正常肝组织标本，作为正常组。采用免疫组织化学染色法检测3组患者组织中NY-ESO-1蛋白表达情况；分析NY-ESO-1蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系；使用Cox比例风险回归模型分析HCC患者预后的危险因素。结果HCC组NY-ESO-1蛋白表达阳性率显著高于癌旁组、正常组；NY-ESO-1蛋白阳性表达患者中肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、微血管侵犯(MVI)为M1/2级患者占比均显著高于NY-ESO-1蛋白阴性表达患者；NY-ESO-1蛋白表达阳性患者的总存活率显著低于NY-ESO-1蛋白表达阴性患者；Cox比例风险回归模型单因素和多因素分析结果显示，肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI为M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的危险因素(HR=4.106、2.184、5.579、13.967、3.296、2.735)(均P＜0.05)。结论NY-ESO-1在HCC组织中呈高表达，且肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的危险因素，临床上可针对上述因素采取相应措施，改善患者预后。

　　【关键词】纽约食管鳞状上皮癌抗原1;原发性肝细胞肝癌;微血管侵犯;预后

　　Expression of New York esophageal squamous cell carcinoma 1 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

　　HUANG Junpeng 1,2,HU Mingyu 1,2*

　　(1.Department of General Surgery,Anqing Medical Center of Anhui Medical University;2.Fifth Clinical Medical College,Anhui Medical University,Anqing,Anhui 246000,China)

　　【Abstract】Objective To investigate the expression of New York esophageal squamous cell carcinoma 1(NY-ESO-1)in hepatocellular carcinoma(HCC)tissues and its clinical significance,in order to provide reference for clinical treatment of this disease.Methods The clinical datas of 71 patients with HCC underwent surgical treatment admitted to Anqing Medical Center of Anhui Medical University from January 2013 to December 2019 were retrospectively analyzed,the paraffin-embedded liver cancer tissue and paracancer tissue samples were collected after surgery,as the HCC group and the paracancer group respectively;the clinical datas of 30 patients with hepatic hemangioma or intrahepatic bile duct calculus were retrospectively analyzed,the paraffin-embedded normal liver tissue samples were collected after surgery,as the normal group.The expression of NY-ESO-1 protein in the three groups were detected by immunohistochemical staining;the relationship between NY-ESO-1 protein expression and clinicopathologic features of HCC patients were analyzed;the risk factors of the prognosis of HCC patients were analysed by Cox proportional risk regression model.Results The positive expression rate of NY-ESO-1 protein in the HCC group was significantly higher than that in the paracancer group and the normal group;the proportion of patients with tumor diameter≥5 cm,Ⅱa~Ⅱb stage,Edmondson gradeⅢ/Ⅳgrade,Ki-67 high expression,microvascular invasion(MVI)grade M1/2 grade in patients with NY-ESO-1 protein positive expression were significantly higher than that in patients with NY-ESO-1 protein negative expression;the overall survival rate of patients with NY-ESO-1 protein positive expression was significantly lower than that of patients with NY-ESO-1 protein negative expression;the results of univariate and multivariate analysis of Cox proportional risk regression model showed that,tumor diameter≥5 cm,Ⅱa~Ⅱb stage,Edmondson gradeⅢ/Ⅳgrade,Ki-67 high expression,MVI grade M1/2 grade,and NY-ESO-1 positive expression were all the risk factors for the prognosis of HCC patients(HR=4.106,2.184,5.579,13.967,3.296,2.735)(all P＜0.05).Conclusion NY-ESO-1 is highly expressed in HCC tissues,and the tumor diameter≥5 cm,Ⅱa~Ⅱb stage,Edmondson gradeⅢ/Ⅳgrade,Ki-67 high expression,MVI grade M1/2 grade,and NY-ESO-1 positive expression are all the risk factors for the prognosis of HCC patients.In clinic,the corresponding measures can be taken according to the above factors,in order to improve HCC patients’outcomes.

　　【Keywords】New York esophageal squamous cell carcinoma 1;Hepatocellular carcinoma;Microvascular invasion;Prognosis

　　原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，HCC患者早期往往没有特异性临床症状，仅有右上腹胀闷、纳差、乏力等不适，当出现明显消瘦、腹水、黄疸症状时，往往病情已比较严重，错过最佳的治疗时机。甲胎蛋白已成为临床诊断HCC应用最为广泛的血清指标，但单一应用甲胎蛋白对肝癌的诊断缺乏敏感性[1-2]。因此，寻找到更灵敏可靠的诊断指标是目前临床肝癌诊治中的研究热点。纽约食管鳞状上皮癌抗原1(NY-ESO-1)是肿瘤睾丸抗原(CTA)亚家族之一，编码基因最早发现于食管癌组织cDNA表达文库中，NY-ESO-1能激发机体产生细胞免疫和体液免疫，在肿瘤的侵袭和进展中起重要作用，被认为是目前免疫原性最强的肿瘤抗原而备受关注[3-4]。目前对于NY-ESO-1在HCC中的表达及其临床意义尚不明确。鉴于此，本研究旨在探讨NY-ESO-1在HCC组织中的表达及其临床意义，以期为临床治疗该疾病提供参考依据，现报道如下。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料回顾性分析2013年1月至2019年12月于安徽医科大学安庆医学中心接受手术治疗的71例HCC患者的临床资料，并搜集其术后石蜡包埋的肝癌组织与癌旁组织标本，分别作为HCC组、癌旁组。

　　71例HCC患者中男性63例，女性8例；年龄37~79岁，平均(58.63±8.15)岁；BMI 18.65~24.54 kg/m2，平均(20.36±0.22)kg/m2；肝功能Child-Pugh分级[5]：A级41例、B级30例。另回顾性分析同期30例肝血管瘤或肝内胆管结石患者的临床资料，并取其术后石蜡包埋的正常肝组织标本，作为正常组，其中男性25例，女性5例；年龄22~68岁，平均(54.23±7.07)岁；BMI 18.25~24.44 kg/m2，平均(20.31±0.21)kg/m2。两组患者性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，可行对比分析。纳入标准：HCC患者符合《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[6]中的相关诊断标准，且经病理确诊为HCC；HCC患者均行肝癌切除术；无自身免疫性疾病或严重感染性疾病。排除标准：患有其他恶性肿瘤者；合并内分泌或心血管疾病等基础疾病患者；临床资料不完整。研究经院内医学伦理委员会批准。

　　1.2研究方法

　　1.2.1免疫组织化学染色采用免疫组化法测定标本组织中NY-ESO-1的表达状况，标本蜡块连续切片，厚度4μm，取完整组织切片放于40℃的水中使其展平，切片裱附在防脱片处理的进口载玻片上，阵列切片置于60℃恒温烤箱中烤片16 h，保存于切片盒中，置于冰箱5℃保存，切片常规脱蜡、梯度乙醇入水，0.01 mol/L枸橼酸抗原修复液(pH值6.0)放微波炉中高火加热5 min至沸腾，自然冷却15 min以上；3%过氧化氢避光孵育10 min，磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，3 min/次；加入一抗NY-ESO-1(1∶500)于4℃冰箱过夜。次日取出载玻片后室温下孵育30 min，PBS冲洗液再冲洗3次，3 min/次；加入检测试剂盒中的试剂1和试剂2，分别等待25、30 min，使用PBS冲洗液再冲洗3次，3 min/次；DAB显色，自来水冲洗后组织切片取出，在新鲜的苏木素染液缸中放置2 min，再采用流动水反复冲洗，脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

　　1.2.2免疫组织化学染色结果判定由两位高年资病理医师在“双盲”条件下进行评定，采用半定量积分法对癌细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分，计算细胞阳性率：①无阳性细胞为0分，1%~10%阳性细胞为1分，10%<阳性细胞≤50%为2分，50%<阳性细胞≤80%为3分，80%＜阳性细胞≤100%为4分。②按照染色强弱：棕褐色表现3分，棕黄色表现2分，黄色表现计1分，不着色记录0分。将免疫组织化学染色评分=细胞阳性率评分×染色强弱评分，分为3个等级，0~1分为阴性(-)，2~4分为弱阳性(+)，5~8分为阳性(++)，99分及以上为强阳性(+++)[7]。其中阴性为阴性组，弱阳性、阳性、强阳性均为阳性组。

　　1.3观察指标①NY-ESO-1在不同肝组织中的表达情况。②NY-ESO-1蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系，包括肿瘤直径(<5 cm、≥5 cm)、肿瘤分期[根据中国肝癌的分期方案(CNLC)分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb期等]、Edmondson分级(Ⅰ/Ⅱ级、Ⅲ/Ⅳ级)、Ki-67[低表达(Ki-67指数≤10%)、高表达(Ki-67指数＞10%)]、微血管侵犯(MVI)[MVI定义为病理切片中发现微静脉内有成团的癌细胞且周围有明确的内皮细胞环绕，分为M0(未发现MVI)、M1(近癌旁肝组织中出现≤5个MVI)、M2(近癌旁肝组织中出现＞5个MVI)]。③所有患者均定期随访3年或随访追踪至死亡日期，随访方式为电话或门诊，3个月随访1次，记录患者的生存情况，采用Kaplan-Meier生存曲线分析NY-ESO-1阳性患者与NY-ESO-1阴性患者的总生存率。④使用Cox比例风险回归模型分析影响行肝癌切除术的HCC患者生存情况的危险因素。

　　1.4统计学方法使用SPSS 26.0统计学软件进行统计学分析，计数资料以[例(%)]表示，采用χ2检验；采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，行Log-rank检验进行生存分析；采用Cox比例风险模型分析影响肝癌患者术后预后的相关因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 NY-ESO-1在不同肝组织中的表达情况HCC组NY-ESO-1蛋白表达阳性率高达21.13%，显著高于癌旁组、正常组，差异均有统计学意义(χ2=16.772、5.867)，见表1。

　　2.2 NY-ESO-1蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系NY-ESO-1蛋白阳性表达患者中肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI为M1/2级患者占比均显著高于NY-ESO-1蛋白阴性表达患者，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见表2。

　　2.3不同NY-ESO-1表达情况HCC患者生存分析截止随访结束，阳性组患者存活率为38.46%，阴性组患者存活率为53.72%，阳性组显著低于阴性组，差异有统计学意义(χ2=4.322，P＜0.05)，见图1。

　　2.4影响HCC患者预后的单因素分析单因素分析结果显示，肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI为M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的相关因素，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见表3。

　　2.5影响HCC患者预后的Cox回归模型多因素分析将单因素分析中差异有统计学意义的因素纳入Cox比例风险回归模型进行多因素分析，结果显示，肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI为M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的危险因素(HR=4.106、2.184、5.579、13.967、3.296、2.735)，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见表4。

　　3讨论

　　HCC是指来源于肝的上皮组织的一种恶性的肿瘤，发生原因可能是由于慢性病毒性肝炎反复不愈，也可能是由于常年进食被黄曲霉素污染的食物而出现了恶变。长期饮酒的患者也会出现酒精性肝硬化和肝癌的发生，患者有明显的疼痛、乏力、食欲下降，检查甲胎蛋白测定偏高，会有巩膜黄染及贫血，深入研究HCC相关的风险因素对其治疗有重要意义[8]。

　　肿瘤细胞产生的NY-ESO-1蛋白能够诱导细胞毒性T淋巴细胞应答，起到杀伤肿瘤细胞的作用，细胞毒性T淋巴细胞能够识别组织相溶性抗原(HLA)-A2限制性NY-ESO-1157-165抗原肽，从而使NY-ESO-1呈阳性的肿瘤细胞被有效清除，因此NY-ESO-1在未来肿瘤辅助治疗，尤其是免疫治疗方面有重要应用前景[9-10]。NY-ESO-1作为免疫原性很强的肿瘤抗原于多种肿瘤细胞中有表达，但表达比例有所不同，在正常组织仅表达于睾丸组织[11-12]；且殷波等[13]研究报道，NY-ESO-1在膀胱移行细胞癌组织中有较高表达，其表达率随着肿瘤分级的升高而升高，而在癌旁组织无表达。本研究结果亦显示，对于HCC患者，NY-ESO-1蛋白仅表达于HCC肝癌组织中，阳性表达率高达21.13%，而在癌旁组织与正常肝脏组织中无表达，提示NY-ESO-1仅在HCC中表达，在癌旁组织与正常肝组织中不表达。孙发政等[14]研究报道，NY-ESO-1在临床分期早、分化程度高、无淋巴结转移的肺癌组织中表达率较高，提示NY-ESO-1与肺癌患者临床病理特征密切相关。本研究也进一步分析了NY-ESO-1蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系，结果显示，NY-ESO-1蛋白阳性表达患者中肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI为M1/2级的患者占比均显著高于NY-ESO-1蛋白阴性表达患者，提示NY-ESO-1与HCC患者临床病理特征密切相关，有望将其作为临床对HCC患者病情评估，以及癌组织特异性免疫治疗的靶分子、判断预后的指标。

　　肿瘤直径是肿瘤的生物学特性之一，肿瘤直径从另一方面反映了肿瘤的生长速度，当肿瘤直径变大即瘤体体积增大时，提示肿瘤增长速度加快，肿瘤增大会加速破坏包膜，使包膜不完整，容易导致血管侵犯并发生肝内转移，甚至会影响肝癌的治疗效果与预后[15]；CNLC分期是结合患者自身情况、肿瘤情况等综合因素制定的适合中国人的肝癌分期方案，结合肝癌的一般规律，分期越晚，预后越差；在肝细胞癌中最经典和最常用的分级系统为Edmondson分级，其中分级越高代表分化程度越低，肿瘤的分化程度可以体现出其增殖性和侵袭性，其与患者预后密切相关[16]；Ki-67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，与细胞的有丝分裂过程密切相关，在细胞周期的G2期和M期表达最高，而G0期不表达，以此可以识别正常分裂的细胞和肿瘤细胞，并可作为判断患者预后的有效指标[17]；MVI作为判断肝癌术后远期生存的重要指标，可通过门静脉或肝动脉分支导致肝内肿瘤复发或远处转移，进而缩短患者术后的远期生存时间，影响预后[18]；李凤莲等[19]研究报道，乳腺髓样癌患者中NY-ESO-1阴性表达患者病死率显著低于NY-ESO-1阳性表达患者；且邱婷婷[20]报道显示，NY-ESO-1阳性表达是上皮性卵巢癌患者预后的危险因素。本研究中Cox回归模型分析显示，肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的危险因素。因此临床应针对上述因素及时进行监测，并给予对应的干预措施，改善HCC患者预后。

　　综上，NY-ESO-1在HCC组织中呈高表达，且肿瘤直径≥5 cm、Ⅱa~Ⅱb分期、Edmondson分级Ⅲ/Ⅳ级、Ki-67高表达、MVI M1/2级、NY-ESO-1阳性均是影响HCC患者预后的危险因素，临床上可针对上述因素采取相应措施，改善患者预后。

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