[摘要]目的探究氨基酰化酶1（aminoacylase 1,ACY1）激活蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）以及胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路促进骨肉瘤（osteosarcoma,OS）细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的机制。方法采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测成骨细胞系hFOB 1.19与OS细胞系（Saos-2、U2OS、HOS、MG-63）中ACY1的表达水平。通过慢病毒构建ACY1沉默的Saos-2细胞（shACY1组，以shNC组为对照）和ACY1过表达的MG-63细胞（ACY1组，以Vector组为对照），借助CCK-8、克隆形成、划痕愈合及Transwell侵袭实验分析ACY1对OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响，蛋白质印迹法检测EMT标志蛋白（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin）及通路相关蛋白表达；构建荷瘤裸鼠模型，验证ACY1沉默和过表达对体内肿瘤生长、EMT及AKT和ERK通路的作用。结果OS细胞系（Saos-2、U2OS、HOS、MG-63）中ACY1的mRNA和蛋白水平显著高于成骨细胞系hFOB 1.19，差异均有统计学意义（P均<0.05）。与shNC组相比，shACY1组细胞的ACY1蛋白的水平、细胞活力、增殖、迁移、侵袭能力、N-cadherin、Vimentin水平更低，AKT1和ERK1/2蛋白磷酸化水平明显下调；而ACY1组与Vector组相比，上述指标均更高，差异均有统计学意义（P均<0.05）。shACY1组E-cadherin水平高于shNC组，ACY1组E-cadherin水平低于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。裸鼠实验中，shACY1组肿瘤质量、肿瘤组织中N-cadherin、Vimentin蛋白水平及AKT1/ERK1/2磷酸化水平低于shNC组，ACY1组的上述指标高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。裸鼠实验中，shACY1组E-cadherin水平高于shNC组，ACY1组E-cadherin水平低于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论ACY1在OS细胞中上调且激活AKT和ERK通路，促进EMT。

　　[关键词]骨肉瘤；氨基酰化酶1；上皮-间质转化

　　骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一种好发生于儿童和青少年的恶性肿瘤。现阶段，化疗药物联合手术治疗可使部分患者保留患病肢体，并提高5年生存率[1]。然而，转移与复发仍是导致OS预后不良的重要因素，发生转移的OS患者生存率仅为20%[2]，分析OS转移机制对寻找生物标志物和治疗靶点具有重要意义。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指细胞与邻近细胞的紧密黏附、极性和上皮结构丧失并获得间质表型，其特征是迁移能力、侵袭性和迁移能力增强，EMT是OS获得转移能力的重要途径[3]。氨基酰化酶1（aminoacylase 1,ACY1）是一种锌结合金属酶，主要存在于细胞质中，在哺乳动物组织中广泛表达。ACY1通过催化N-酰化氨基酸水解为L-氨基酸和酰基，从而调节蛋白质稳定性[4]。研究表明ACY1在人类癌症中发挥作用，ACY1在肺癌中过表达且与免疫抑制相关[5]。在肝细胞癌中，ACY1能够通过调节转化生长因子β1促进EMT[6]。值得注意的是，转化生长因子β1是诱导OS细胞EMT的重要通路[7]。然而，ACY1是否会促进OS细胞的EMT则仍不清楚。据此，本研究分析ACY1对OS细胞以及EMT的影响，并探究其作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1细胞培养与转染

　　将人成骨细胞系hFOB 1.19（美国ATCC公司）与人OS细胞系Saos-2、U2OS、HOS和MG-63（美国ATCC公司）培养于DMEM培养基（含10%胎牛血清及1%谷氨酰胺），环境条件设置为37℃、5%CO 2。根据1.2和1.3的方法分别检测hFOB 1.19、Saos-2、U2OS、HOS和MG-63细胞中ACY1 mRNA和蛋白水平。

　　依据ACY1表达水平筛选实验细胞：选取ACY1相对高表达的Saos-2细胞用于沉默实验，选取ACY1相对低表达的MG-63细胞用于过表达实验。将Saos-2细胞分为shNC组和shACY1组，针对Saos-2细胞的沉默实验，设计3种sh-ACY1序列（sh-ACY1-1、sh-ACY1-2、sh-ACY1-3）并将其分别插入pGMLV-SC5载体，转染Saos-2细胞后通过检测筛选沉默效率最高的sh-ACY1序列，用于后续shACY1组的构建。shNC组细胞转染包含sh-NC的pGMLV-SC5载体，作为对照。将MG-63细胞分为空载体（Vector）组和ACY1组。针对MG-63细胞的过表达实验，构建ACY1 pcDNA 3.1过表达载体，以空载体（Vector）作为对照，分别转染MG-63细胞构建ACY1组和Vector组。sh-ACY1和ACY1 pcDNA 3.1的转染方法如下：转染体系包含1.5×105个细胞、慢病毒载体（感染复数=10）和聚凝胶（5μg/mL）。转染24 h后通过检测ACY1的mRNA及蛋白水平评估转染效率。

　　1.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

　　裂解细胞萃取总RNA并通过逆转录cDNA试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）合成cDNA。采用SYBR Green PCR预混液（瑞士Roche公司）与PCR检测系统进行qPCR实验。PCR循环程序：95℃预变性10 min；94℃下15 s、60℃下1 min进行40个循环；最终60℃延伸1 min后4℃保存。采用比较循环阈值法分析RNA表达，以GAPDH作为内参基因。引物序列见表1。

　　1.3蛋白质印迹法（Western blot）

　　使用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，通过SDS-PAGE（恒定电压110 V，电泳100 min）进行蛋白分离，随后转膜至PVDF膜（恒定电压90 V，转膜90 min）。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，加入1∶500稀释的一抗（美国Abcam公司）4°C孵育过夜。随后以1:5 000稀释的二抗（sc-516102、sc-2357，美国Santa Cruz Biotechnology公司）室温孵育2 h。最后采用Pierce™ECL化学发光底物（美国Thermo Fisher公司）于ChemiDoc MP成像系统（美国Bio-Rad公司）检测蛋白条带。检测的蛋白包括ACY1蛋白、EMT标志蛋白（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）通路与胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路及其他通路激活相关蛋白。

　　1.4 CCK-8检测细胞活力

　　将细胞以每孔1×104个细胞（100μl）的密度接种于96孔板。培养48 h后，每孔加入10μl CCK-8试剂（中国碧云天公司），37℃继续孵育2 h。使用酶标仪（瑞士Tecan Infinite M200）在450 nm波长处测量光密度值。

　　1.5克隆形成实验

　　将500个细胞接种于6孔板每孔中。培养48 h后，用甲醇固定细胞集落，0.5%结晶紫染色20 min。在显微镜下观察并计数细胞集落。

　　1.6划痕愈合实验

　　将1×106个细胞接种于6孔板，培养至90%融合度。用200μl移液器吸头划痕后洗涤细胞，继续培养24 h。使用倒置显微镜（日本奥林巴斯IX71）拍摄划痕区域图像。

　　1.7 Transwell侵袭实验

　　将1×105个细胞接种于铺有基质胶（8μm孔径，美国BD Biosciences公司）的Transwell上室。下室加入完全培养基作为化学引诱剂。48 h后取出Transwell装置，洗涤后使用20%甲醇固定细胞，0.2%结晶紫染色，通过倒置显微镜（日本奥林巴斯IX71）观察。

　　1.8裸鼠异种移植瘤模型

　　4周龄、雄性、体质量为16~18 g的BALB/c裸鼠购自北京维通利华公司，在咸宁市第一人民医院的实验动物中心SPF级屏障设施内，标准条件下（12/12 h明暗循环，自由进食饮水）饲养。裸鼠分组1（n=4）：shNC组和shACY1组，分别利用shNC组与shACY1组的Saos-2细胞构建荷瘤裸鼠模型；裸鼠分组2（n=4）：Vector组和ACY1组，分别利用Vector组和ACY1组的MG-63细胞构建荷瘤裸鼠模型。每组裸鼠皮下注射1×106个相应细胞，分别注射到无特定病原体级4周龄BALB/c裸鼠腋下。注射28d后处死裸鼠，取出肿瘤组织进行称重与拍照。本实验经咸宁市第一人民医院伦理委员会批准（No.012-202511-02）并在实验过程中最大限度减轻动物痛苦。

　　1.9统计方法

　　使用GraphPad Prism 7统计学软件进行统计分析，组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1成骨细胞系hFOB 1.19与OS细胞系中ACY1 mRNA和蛋白水平比较

　　OS细胞U2OS、Saos-2、HOS和MG-63中ACY1 mRNA和蛋白的表达水平高于成骨细胞hFOB 1.19，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图1。

　　U2OS、HOS和MG-63中ACY1 mRNA的表达水平；图B为Western blot检测上述细胞中ACY1蛋白的表达水平；与成骨细胞系hFOB 1.19比较，*P<0.05。

　　2.2 ACY1沉默与过表达对OS细胞ACY1蛋白水平、细胞活力及增殖能力的影响分析

　　shACY1组的ACY1蛋白的水平低于shNC组，ACY1组的ACY1蛋白水平高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图2A、图2B。shACY1组的细胞活力低于shNC组，ACY1组的细胞活力高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图2C、图2D。shACY1组的增殖能力低于shNC组，ACY1组的增殖能力高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图2E、图2F。

　　2.3 ACY1沉默与过表达对OS细胞迁移和侵袭能力的影响分析

　　shACY1组细胞迁移能力与细胞侵袭能力低于shNC组，ACY1组细胞迁移能力与细胞侵袭能力高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图3。

　　2.4 ACY1沉默与过表达对OS细胞中EMT标志蛋白表达水平的影响分析

　　shACY1组细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白水平低于shNC组，E-cadherin蛋白水平高于shNC组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图4A。ACY1组细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白水平高于Vector组，E-cadherin蛋白水平低于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图4B。

　　2.6 ACY1沉默与过表达对裸鼠体内肿瘤生长、AKT和ERK蛋白磷酸化水平、EMT标志蛋白表达水平的影响分析

　　shACY1组的肿瘤质量小于shNC组，ACY1组的肿瘤质量高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图6A、图6B。shACY1组肿瘤组织中AKT1和ERK1/2蛋白磷酸化水平低于shNC组，ACY1组肿瘤组织中AKT1和ERK1/2蛋白磷酸化水平高于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图6C、图6D。shACY1组肿瘤组织中N-cadherin和Vi⁃mentin蛋白水平低于shNC组，E-cadherin蛋白水平显著高于shNC组；ACY1组肿瘤组织中N-cadherin和Vimentin蛋白水平高于Vector组，E-cadherin蛋白水平低于Vector组，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图6E、图6F。

　　3讨论

　　转移是导致OS患者预后不良的主要原因，对于发生转移和复发的OS患者，放化疗效果有限，死亡率高[8]。因此，研究OS细胞增殖与转移的机制具有重要意义。

　　在正常机体内，ACY1蛋白在肾脏和脑中表达，主要以蛋白酶形式定位于细胞质，ACY1能够水解细胞内蛋白质N端肽段的α-酰化氨基酸，且有研究表明ACY1功能失调可能引发自闭症与惊厥[9]。ACY1水平与多种肿瘤相关，但是在不同癌症中ACY1的作用可能不同，如在结直肠癌中，ACY1过表达且高水平ACY1与结直肠晚期TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯阳性及低生存率显著相关；体外实验也证实沉默ACY1可显著抑制HCT116细胞增殖并诱导细胞凋亡[10]。GUO M等[11]的研究发现ACY1在前列腺癌中上调，且高水平的ACY1与不良预后有关。而在神经母细胞瘤中，靶向抑制ACY-1能够促进神经母细胞瘤细胞的迁移和侵袭[12]。肾透明细胞癌组织中ACY1的表达均下调，体外提高ACY1蛋白水平会促进肾透明细胞癌的细胞活力和迁移能力[13]。但是ACY1在OS中的作用仍不清楚。本研究结果显示OS细胞系中ACY1上调，且沉默ACY1导致细胞增殖、迁移和侵袭能力均减弱，而过表达ACY1显著促进MG-63细胞的增殖、迁移和侵袭。这初步提示ACY1在OS中发挥促癌作用。

　　本研究探讨ACY1在OS中的调控机制，结果显示沉默ACY1显著抑制EMT并降低AKT1和ERK1/2蛋白磷酸化水平，而过表达ACY1则促进EMT，并升高了AKT1和ERK1/2蛋白磷酸化水平。AKT与ERK均是受体酪氨酸激酶下游信号通路中的关键蛋白，研究表明激活AKT通路能够显著促进OS细胞的EMT[14]。而抑制ERK通路则会导致OS细胞的EMT能力显著减弱[15]。此外，过往研究表明ACY1具有参与细胞内信号转导的作用，CHEN H等[16]的研究显示ACY1可通过激活AKT通路促进非小细胞肺癌进展。也有研究显示ACY1的升高会促进胶质母细胞瘤中ERK蛋白磷酸化[17]。本研究的动物实验结果显示，ACY1具有激活OS肿瘤组织中AKT和ERK通路的作用，提示ACY1会激活AKT和ERK通路并促进OS细胞EMT，提高OS细胞迁移和侵袭能力。

　　本研究也存在一些不足之处，首先关于ACY1在OS中的临床表达特点和与病理学的关系仍需要进一步研究，关于ACY1调控AKT和ERK通路的具体机制也需要进一步探索，这也是后续研究重点。

　　综上所述，ACY1在OS细胞中上调且激活AKT和ERK通路促进EMT，这可能促进OS进展并成为治疗的新靶点。

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