[摘要]目的探究香豆素（coumarin,Cmn）对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响，阐明其抗胃癌的作用机制，为开发新型抗胃癌药物提供实验依据。方法自中国科学院细胞库购入人胃癌SGC-7901细胞株，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，采用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验，并采用细胞增殖抑制率测定法测定不同浓度Cmn（0、10、20、40、80、160μmol/L）对SGC-7901细胞增殖的影响；细胞凋亡检测法检测细胞凋亡率；细胞形态学观察细胞凋亡形态学变化；流式细胞术分析细胞周期分布；蛋白质免疫印迹检测凋亡相关蛋白如Bcl-2相关X蛋白（bcl-2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2 protein,Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9,caspase-9）、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]及磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki⁃nase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）信号通路相关蛋白表达变化。结果Cmn以浓度和时间依赖性方式抑制SGC-7901细胞增殖，24、48、72 h的IC50值分别为（108.23±5.67）μmol/L、（62.40±3.25）μmol/L、（32.76±2.84）μmol/L，差异有统计学意义（F=427.10，P<0.001）；Cmn显著增加细胞凋亡率，0、40、80μmol/L的Cmn处理组的细胞总凋亡率分别为（4.11±0.58）%、（22.88±2.63）%、（42.23±3.87）%，差异有统计学意义（F=147.105，P<0.001）；流式细胞术结果显示，Cmn处理48 h后，G0/G1期细胞比例显著增加，而S期和G2/M期细胞比例减少，差异均有统计学意义（P均<0.05）；蛋白质免疫印记分析表明Cmn处理48 h后，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2比值升高；同时，caspase-3、caspase-9活化形式表达增加，PARP裂解产物表达上调，PI3K和磷酸化AKT（phosphorylated AKT,p-AKT）表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P均<0.05），总AKT表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论Cmn通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期抑制SGC-7901细胞增殖，其机制与上调促凋亡蛋白、下调抗凋亡蛋白表达及抑制PI3K/AKT信号通路有关。

　　[关键词]香豆素；胃癌；细胞凋亡；细胞周期；PI3K/AKT信号通路

　　胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居于前列[1]。目前，胃癌的治疗主要包括手术切除、化疗及放疗等，但疗效仍不理想，尤其是中晚期患者5年生存率较低[2]。传统化疗药物虽然具有一定疗效，但不良反应较大，且易产生耐药性。因此，寻找高效低毒的新型抗胃癌药物具有重要的临床意义。

　　香豆素（coumarin,Cmn）是一类广泛存在于植物中的苯并α-吡喃酮化合物，在多种中药和植物中含量丰富，如肉桂、甘草、白花蛇舌草等[3]。研究表明，Cmn及其衍生物具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物和抗肿瘤等作用[4]。近年来，Cmn的抗肿瘤活性受到广泛关注，研究发现其对多种肿瘤细胞如乳腺癌、肝癌、结肠癌等具有显著抑制作用[5]。然而，Cmn对胃癌细胞的作用及其分子机制尚未完全阐明。细胞凋亡是一种受控的细胞死亡过程，是机体清除异常或受损细胞的重要机制，也是抗肿瘤药物发挥作用的主要途径之一[6]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）信号通路是调控细胞增殖、凋亡和代谢的关键通路，该通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关[7]。本研究旨在探究Cmn对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响，阐明其抗胃癌的作用机制，为开发新型抗胃癌药物提供实验依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1细胞株与试剂人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）购自Gibco公司；Cmn（纯度>98%）购自Sigma公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）购自Sigma公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC）/碘化丙啶（prop⁃idium iodide,PI）凋亡检测试剂盒购自BD公司；Hoechst 33258染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；细胞周期检测试剂盒购自BD公司；Bcl-2相关X蛋白（bcl-2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2 pro⁃tein,Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9,caspase-9）、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、PI3K、AKT、磷酸化AKT（phos⁃phorylated AKT,p-AKT）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体购自Cell Signaling Technology公司；增强型化学发光法（enhanced chemiluminescence,ECL）试剂盒购自Millipore公司。

　　1.1.2主要仪器CO2培养箱（Thermo Fisher公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪（BD公司）；荧光显微镜（Nikon公司）；酶标仪（BioTek公司）；离心机（Eppendorf公司）；电泳仪（Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

　　1.2实验方法

　　1.2.1细胞培养人胃癌SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。采用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.2.2细胞增殖抑制率测定（MTT法）取对数生长期SGC-7901细胞，制成5×104个/mL细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl，培养24 h后加入不同浓度Cmn（0、10、20、40、80、160μmol/L，以DMSO配制，终浓度<0.1%），每个浓度设5个复孔。培养24、48、72 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20μl，继续培养4 h，弃去上清液，加入DMSO 150μl，振荡15 min，酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值。计算细胞增殖抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。根据细胞增殖抑制率计算各时间点的IC50值。

　　1.2.3细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI双染法）取对数生长期SGC-7901细胞，接种于6孔板中，培养24 h后，分别加入0、40、80μmol/L Cmn，培养48 h。消化收集细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗涤2次，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用Flow Jo软件对细胞凋亡结果进行分析，每组实验均独立重复3次（n=3）。

　　1.2.4细胞形态学观察（Hoechst 33258染色）取对数生长期SGC-7901细胞，接种于盖玻片上，培养24 h后，分别加入0、40、80μmol/L Cmn，培养48 h。PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗涤2次，加入Hoechst 33258染液（10μg/mL）染色20 min，PBS洗涤后，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照，每组实验均独立重复3次（n=3）。

　　1.2.5细胞周期分析（流式细胞术）取对数生长期SGC-7901细胞，接种于6孔板中，培养24 h后，分别加入0、40、80μmol/L Cmn，培养48 h。消化收集细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定4 h以上，PBS洗涤，加入RNase A(100μg/mL)37℃孵育30 min，PI(50μg/mL)染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布，采用Flow Jo软件对细胞周期结果进行分析，每组实验均独立重复3次（n=3）。

　　1.2.6蛋白质免疫印迹（western blot,WB）分析取对数生长期SGC-7901细胞，接种于6孔板中，培养24 h后，分别加入0、40、80μmol/L Cmn，培养48 h。收集细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、PARP、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH，1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗（1∶5 000稀释）室温孵育

　　1 h，TBST洗涤3次，ECL显影，凝胶成像系统拍照，Image J软件分析各组Bax、Bcl-2、caspase-3、cas⁃pase-9、PARP、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH的条带灰度值，蛋白相对表达量=蛋白光密度值/GAPDH光密度值，每组实验均独立重复3次（n=3）。

　　1.3观察指标

　　①不同浓度Cmn对SGC-7901细胞增殖的影响。

　　②不同浓度Cmn对SGC-7901细胞凋亡的影响。

　　③不同浓度Cmn对SGC-7901细胞周期分布的影响。

　　④不同浓度Cmn对凋亡相关蛋白表达的影响。

　　⑤不同浓度Cmn对PI3K/AKT信号通路的影响。

　　1.4统计方法

　　采用SPSS 22.0统计学软件对文内所有数据分析和处理，细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞周期分布以及凋亡相关蛋白和信号通路蛋白的表达水平均属于计量资料，经Shapiro-Wilk检验评估均符合正态分布，以(±s）表示，组间比较行两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，不同时间点比较采用多因素重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1不同浓度Cmn对SGC-7901细胞增殖的影响MTT实验结果显示，Cmn以浓度和时间依赖性方式抑制SGC-7901细胞增殖。随着Cmn浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐增加，见表1。且24、48、72 h的IC50值分别为（108.23±5.67）μmol/L、（62.40±3.25）μmol/L、（32.76±2.84）μmol/L，差异有统计学意义（F=427.10，P<0.001）。

　　2.2不同浓度Cmn对SGC-7901细胞凋亡的影响

　　由表1 MTT实验结果显示，细胞经40μmol/L和80μmol/L Cmn刺激48 h后抑制率分别为（35.82±3.12）%、（58.23±3.64）%，能清晰反映剂量依赖性凋亡效应，而10μmol/L和20μmol/L抑制率较低，分别为（13.43±1.85）%、（25.76±2.43）%，160μmol/L抑制率为（82.45±4.53）%，抑制过强易混杂坏死效应影响实验结果。因此后续实验选取0、40、80μmol/L的Cmn刺激SGC-7901细胞48 h。Annexin V-FITC/PI双染结果显示，与0μmol/L Cmn相比，Cmn处理48 h后，细胞凋亡率明显增加，并且随着Cmn浓度的增加，凋亡率逐渐升高，见表2。Hoechst 33258染色结果显示，0μmol/L Cmn时细胞核染色均匀，形态规则；而Cmn处理组细胞出现典型的凋亡形态学特征，如染色质浓缩、核固缩、细胞皱缩等，且随着Cmn浓度的增加，凋亡细胞数量增多。

　　2.3不同浓度Cmn对SGC-7901细胞周期分布的影响

　　流式细胞术分析表明，与0μmol/L Cmn相比，Cmn处理48 h后，G0/G1期细胞比例显著增加，而S期和G2/M期细胞比例减少，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表3。

　　2.4不同浓度Cmn对凋亡相关蛋白表达的影响

　　WB分析结果显示，与0μmol/L Cmn相比，Cmn处理48 h后，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2比值升高；同时，cas⁃pase-3、caspase-9活化形式表达增加，PARP裂解产物表达上调，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表4。

　　2.5不同浓度Cmn对PI3K/AKT信号通路的影响

       WB分析结果表明，与0μmol/L Cmn相比，Cmn处理48 h后，PI3K和磷酸化AKT（p-AKT）表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P均<0.05），而总AKT表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

　　3讨论

　　胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高[1]。寻找高效低毒的抗胃癌药物一直是研究的热点。Cmn作为一种天然化合物，具有多种药理活性，包括抗肿瘤作用[4]。本研究探讨了Cmn对人胃癌SGC-7901细胞的影响及其作用机制，为开发新型抗胃癌药物提供理论依据。

　　本研究结果表明，Cmn能够以浓度和时间依赖性方式抑制SGC-7901细胞增殖。细胞凋亡是肿瘤治疗的关键靶点，诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物的重要作用机制之一[8]。凋亡细胞通常表现出一系列形态学和生化特征，如细胞皱缩、染色质浓缩、核固缩、磷脂酰丝氨酸外翻等[9]。本研究通过Annexin V-FITC/PI双染和Hoechst 33258染色观察到，Cmn处理后SGC-7901细胞出现典型的凋亡形态学特征，凋亡率显著增加，表明Cmn可诱导SGC-7901细胞凋亡。细胞周期失控是肿瘤发生发展的重要特征之一[10]。流式细胞术分析显示，Cmn可导致SGC-7901细胞在G0/G1期阻滞，表明Cmn能够干扰细胞周期进程，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。细胞凋亡过程受多种蛋白调控，其中Bcl-2家族蛋白和caspase家族蛋白扮演重要角色[11]。Bcl-2家族成员包括促凋亡蛋白（如Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2），两者平衡决定细胞命运。Bax/Bcl-2比值升高会促进细胞色素c从线粒体释放，激活caspase-9，进而激活下游的caspase-3，切割PARP等底物，最终导致细胞凋亡[12]。本研究WB结果显示，Cmn处理后，SGC-7901细胞Bax表达上调，Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2比值升高；同时，活化的caspase-3、caspase-9及PARP裂解产物表达增加，表明Cmn可能通过线粒体通路诱导SGC-7901细胞凋亡。PI3K/AKT信号通路是调控细胞增殖、凋亡和代谢的关键通路，在多种肿瘤中异常激活[7]。PI3K活化后促进AKT磷酸化，磷酸化的AKT进一步调控下游靶蛋白，促进细胞增殖和抑制凋亡[13]。本研究结果表明，Cmn处理后，SGC-7901细胞PI3K和p-AKT表达水平显著降低，而总AKT表达无明显变化，提示Cmn可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，促进胃癌细胞凋亡。

　　综上所述，Cmn能够通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，其作用机制与上调促凋亡蛋白、下调抗凋亡蛋白表达及抑制PI3K/AKT信号通路有关。这些结果为Cmn抗胃癌作用提供了科学依据，为开发新型抗胃癌药物提供了理论基础。然而，本研究仍存在一些局限性：①仅在体外单一细胞株上进行实验，未来应扩展到多种胃癌细胞株和体内动物模型；②对Cmn抗胃癌的分子机制探讨还不够深入，需要进一步研究其对其他信号通路的影响；③未探讨Cmn与临床常用化疗药物的协同作用。以上问题有待在今后的研究中进一步解决。

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