[摘要]目的探讨橄榄苦苷（oleuropein,OLE）对视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞恶性生物学行为的影响及其机制。方法以2024年1—7月牡丹江医科大学体外培养的WERI-Rb-1细胞为实验对象，按OLE实验浓度不同分为4组，即对照组和OLE低剂量组（5 mg/mL）、OLE中剂量组（10 mg/mL）、OLE高剂量组（20 mg/mL）。分别采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）实验、集落形成实验、划痕实验、Transwell实验和蛋白质免疫印迹实验检测各组WERI-Rb-1细胞增殖活力、克隆形成率、迁移能力、侵袭能力、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K,p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）和磷酸化AKT（phosphorylated AKT,p-AKT）的蛋白表达水平。结果对照组和OLE低剂量组、OLE中剂量组、OLE高剂量组的细胞增殖活力、细胞克隆形成率、细胞迁移率、穿膜细胞数比较，差异均有统计学意义（P均<0.05）。且经蛋白质免疫印迹实验检测结果显示，OLE剂量越大，MMP-9、p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P均<0.01），但PI3K、AKT蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）。结论高剂量OLE可抑制视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与下调MMP-9、p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白表达水平有关。

　　[关键词]橄榄苦苷；视网膜母细胞瘤；增殖；迁移；侵袭

　　视网膜母细胞瘤预后极差，其恶性程度高并且较早发生转移。目前，视网膜母细胞瘤治疗尚无特异性手段，并且化疗效果有限，无法改善远处复发和转移[1-2]。以手术为主，辅以放疗、化疗的视网膜母细胞瘤治疗方案，效果并不理想，致死率和致盲率极高。虽然，分子靶向治疗等新型疗法已经应用于视网膜母细胞瘤的治疗，但是预后依然较差，5年生存率很低。临床上急需新的视网膜母细胞瘤治疗方法和新型药物。不良反应小的中药单体目前已经成为研究热点。橄榄苦苷（oleuropein,OLE）是木犀科植物的主要活性成分之一，具有多种药理作用，在对OLE药理作用的研究中，其抑制肿瘤细胞活性的药理作用受到关注[3-4]。探讨OLE对视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞恶性生物学行为干预作用及其分子机制，为OLE应用于视网膜母细胞瘤治疗和新药开发提供新的思路。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　细胞系：人视网膜母细胞瘤细胞系WERI-Rb-1，购自哈尔滨芙拉瑞生物科技有限公司。主要仪器与试剂：OLE：纯度>98%（货号：SM5036）、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）试剂盒、基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9,MMP-9）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoInositide 3-kinase,PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K,p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）、磷酸化AKT（phos⁃phorylated AKT,p-AKT）抗体，均购自上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司。ELX800酶标仪（美国Bio-Tek仪器公司）；化学发光凝胶成像系统和垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。以2024年1—7月牡丹江医科大学体外培养的WERI-Rb-1细胞为实验对象，按OLE实验浓度不同分为4组，即对照组和OLE低剂量组（5 mg/mL）、OLE中剂量组（10 mg/mL）、OLE高剂量组（20 mg/mL），其中，对照组给予常规培养。

　　1.2实验方法

　　1.2.1细胞培养将WERI-Rb-1细胞（传代2~3次）接种于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中进行常规培养。细胞置于37℃恒温培养箱中，在5%CO2环境下每隔3~4 d换液1次。

　　1.2.2 CCK-8实验将WERI-Rb-1细胞悬液以1×105个/mL的密度铺板至96孔细胞培养板中，每组实验设置3个复孔以保证数据可靠性。培养48 h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2的条件下孵育1 h后计算细胞增殖活力。

　　1.2.3集落形成实验将WERI-Rb-1细胞放置于10%FBS RMPI 1640培养基中培养，并在6孔板中（每孔1 000个细胞），按“1.1”的方法进行分组和处置，培养7~10 d，多聚甲醛固定、结晶紫染色。计录直径>0.1 mm的集落数量并计算克隆形成率。

　　1.2.4划痕实验将WERI-Rb-1细胞在6孔板培养，密度5×106个，划痕后于0、24 h倒置光学显微镜分别在40倍下拍照。细胞迁移率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

　　1.2.5 Transwell实验将200μl WERI-Rb-1细胞悬液接种于铺基底胶的Traswell小室上室，按分组与给药方法处理细胞，在下室加入完全培养液600μl，培养24 h。多聚甲醛固定、结晶紫染色后计算穿膜细胞数。

　　1.2.6蛋白质免疫印迹实验收集WERI-Rb-1细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度后分离蛋白、转膜、封闭、孵育，以GAPDH为内参，Image J软件量化MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白灰度值。

　　1.3观察指标

　　①比较各组WERI-Rb-1细胞增殖活力。

　　②比较各组WERI-Rb-1细胞克隆形成率。

　　③比较各组WERI-Rb-1细胞迁移率。

　　④比较各组WERI-Rb-1细胞穿膜细胞数。

　　⑤比较各组WERI-Rb-1细胞MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达水平。

　　1.4统计方法

　　采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，经Shapiro-Wilk检验符合正态分布的计量资料（增殖活力、克隆形成率、迁移率、穿膜细胞数及MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达水平）用(±s）表示，组间比较行两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1各组WERI-Rb-1细胞增殖活力的比较

　　CCK-8实验数据显示，各组WERI-Rb-1细胞增殖活性呈现剂量依赖性下降趋势，且4组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

　　2.2各组WERI-Rb-1细胞克隆形成率的比较

　　集落形成实验数据显示，各组WERI-Rb-1细胞克隆形成率呈现剂量依赖性下降趋势，且4组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

　　2.3各组WERI-Rb-1细胞迁移能力的比较

　　划痕实验数据显示，各组WERI-Rb-1细胞迁移率呈现剂量依赖性下降趋势，且4组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

　　2.4各组WERI-Rb-1细胞侵袭能力的比较

　　Transwell实验数据显示，各组WERI-Rb-1细胞穿膜细胞数呈现剂量依赖性下降趋势，且4组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

　　2.5各组WERI-Rb-1细胞MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平的比较

　　蛋白质免疫印迹实验数据显示，与对照组比较，各组WERI-Rb-1细胞MMP-9、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平呈现剂量依赖性下降趋势，且4组比较差异均有统计学意义（P均<0.05），但PI3K、AKT蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）。见表5。

　　3讨论

　　目前，依靠化疗治疗视网膜母细胞瘤，不仅效果有限，而且化疗的强烈不良反应令患者难以耐受，临床上急需新型药物应用于治疗该疾病。有研究发现，中药在对抗肿瘤的应用中，不仅疗效好，而且可以减轻化疗药物的不良反应，增强患者的耐受能力和免疫能力，抑制肿瘤细胞的增殖[4-11]。针对OLE的药理作用的研究表明，OLE可以通过调节Notch/Hes-1信号通路抑制宫颈癌细胞增殖与凋亡，OLE还可以通过RhoA/ROCK信号通路减轻子宫内膜癌化疗的耐药性[12-13]；OLE还可以抑制胃癌AGS细胞增殖；调控circMBOAT2/miR-106a-5p信号通路降低口腔鳞癌细胞增殖和凋亡[14-15]。本研究结果显示：经OLE处理后，WERI-Rb-1细胞增殖能力显著下降（P<0.05），这表明OLE对WERI-Rb-1细胞增殖能力具有抑制作用。

　　迁移和侵袭是肿瘤细胞主要的恶性生物学行为，与肿瘤发展密切相关，MMP在其中发挥了重要作用。MMP是一类结构相似的锌依赖性内肽酶家族，目前发现有23个酶，主要通过降解细胞外基质组分，在组织重塑、炎症反应以及肿瘤发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。MMP-2和MMP-9是MMP中重要类型之一，可以通过降解细胞外基质，帮助肿瘤细胞突破基底膜和周围组织，促进肿瘤侵袭和进展。研究表明，中药单体可以通过调控信号转导通路和MMP-9蛋白表达水平抑制胶质瘤和胆囊癌细胞的侵袭和转移[15-16]。本研究结果显示：经OLE处理后，WERI-Rb-1细胞迁移率、穿膜细胞数和MMP-9蛋白表达水平均显著降低（P均<0.05），这表明OLE对WERI-Rb-1细胞迁移和侵袭能力具有抑制作用。

　　经典信号通路PI3K/AKT与细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等方面关系十分密切，PI3K/AKT信号传导系统在肿瘤发生机制中具有重要调控作用[16-19]。该通路异常活化可引发下游凋亡调控、细胞迁移及增殖相关蛋白功能改变，从而促进肿瘤的恶性转化及进展。PI3K作为核心酶分子，由p85亚基与p110亚基形成复合结构。在外界信号刺激下，该酶催化磷酸化反应，将底物PIP2转化为PIP3。AKT家族（包括AKT1、AKT2、AKT3三个亚型）作为该通路的关键效应分子，属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族。其激活机制涉及与膜磷脂PIP3的特异性结合，促使AKT分子从胞质向胞膜转位并完成构象激活。活化后的AKT通过级联磷酸化作用调控多个功能蛋白：包括促凋亡蛋白BAD的去活化修饰、FOXOs转录因子核质转运的调控，以及抗凋亡蛋白Bcl-2家族的表达调节，共同参与调控细胞周期、增强侵袭转移能力和抑制凋亡等肿瘤生物学过程，在恶性肿瘤演进中发挥关键性调控作用。例如，AKT在Ser473处的磷酸化可以调控促凋亡蛋白的表达来改变细胞凋亡能力。研究发现，CDK12促进PI3K/AKT信号通路的异常活化在胃癌进展中发挥核心调控作用[20]。PI3K/AKT信号通路的激活还能调节MMP的活性，促进上皮间质转化，降低细胞间的黏附性，增强胃癌细胞的转移能力。本研究结果显示：经OLE处理后，WERI-Rb-1细胞PI3K、AKT蛋白表达水平无显著差异（P均>0.05），p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平降低（P均<0.05），这表明OLE通过抑制PI3K/AKT信号通路对WERI-Rb-1细胞的恶性生物学行为起到抑制作用。

　　综上所述，高剂量OLE可抑制视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与下调MMP-9、p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白表达水平有关。视网膜母细胞瘤的主要的恶性生物学行为是增殖、迁移和侵袭，本研究将为OLE早日应用于视网膜母细胞瘤临床治疗和新型药物开发提供新的思路。

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