[摘要]目的研究胆管结扎对大鼠脑内和外周血血清素及相关物质的影响。方法2024年7—9月在蚌埠医科大学进行实验，将16只SD大鼠分为假手术组（n=6）和胆管结扎组（n=10），造模14 d后，胆管结扎组选择6只大鼠进行后续实验，进行体质量、肝质量等生理参数、谷丙转氨酶和谷草转氨酶等肝损伤指标以及肝脏单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）（包括MAO-A和MAO-B）活性的检测；用高效液相色谱法进行皮层、海马、纹状体及血浆中血清素及其相关物质（色氨酸、5-羟色氨酸和5-羟吲哚乙酸）的检测。结果胆管结扎组肝脏质量、肝损伤指标水平均高于假手术组，差异有统计学意义（P均<0.05）。胆管结扎组MAO-A（0.10±0.02）absorbance/mg protein、MAO-B（0.18±0.05）absorbance/mg protein，均低于假手术组的活性（0.14±0.03）absor‐bance/mg protein、（0.26±0.06）absorbance/mg protein，差异有统计学意义（t=2.985、2.679，P均<0.05）。胆管结扎组皮层和纹状体中色氨酸、5-羟色胺和5-羟吲哚乙酸含量高于假手术组血浆中的5-羟色氨酸含量高于假手术组，差异有统计学意义（P均<0.05）。结论胆管结扎引起的大鼠胆汁淤积肝损伤模型成功建立；单胺氧化酶活性的改变可能引起外周血清素及相关物质浓度的改变；各脑区和血浆中血清素及相关物质不同程度的改变，提示胆管结扎引起的肝损伤，可进一步引起脑内和外周血清素代谢紊乱。

　　[关键词]胆管结扎；胆汁淤积；肝损伤；血清素；单胺氧化酶

　　胆管结扎是建立稳定的胆汁淤积型肝损伤模型的方法[1-4]。相关前期研究中已经发现胆管结扎能够引起大鼠脑内多巴胺的代谢紊乱[5]。而5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）与多巴胺都和精神状态相关，胆管结扎有引发5-HT水平紊乱的可能[6]。5-HT的主要合成途径为：色氨酸（tryptophan,Trp）经色氨酸羟化酶2代谢生成5-羟色氨酸（5-hy‐droxytryptophan,5-HTP），经脱羧后生成5-HT。5-HT主要经单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）（包括MAO-A和MAO-B）代谢生成5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA），最终排出体外[7-9]。由于血脑屏障的存在，外周和脑内5-HT的合成和代谢是相对独立的[10]。因此，本研究拟针对胆管结扎对大鼠脑内和外周血中5-HT的代谢的影响。由于MAO酶活性在脑内显著性下调的现象已经被报道[5]，所以仅研究外周（肝脏）MAO酶活性。

　　1材料与方法

　　1.1动物模型的建立

　　将适应性喂养7 d的16只体质量约220 g的Sprague Dawley（SD）大鼠分成假手术组（6只）和胆管结扎组（10只）。假手术组仅进行胆管的分离但不结扎，胆管结扎组分离胆管并结扎[5]。本研究获得蚌埠医科大学动物伦理委员会批准（伦动科批字[2023]第167号）。动物饲养在简要恒温（23±1）℃和恒湿（55±5）%的环境中，并给予标准饲料，饮水自由。术后14 d，选择6只存活且精神状态良好的胆管结扎组大鼠完成后续实验。分别取两组肝脏组织、大鼠脑部皮层前额、海马、纹状体、血浆和血液，-80℃保存。

　　1.2实验材料

　　试剂盒均来自南京建成生物工程研究所；Trp来自上海阿达玛斯公司；5-HTP和5-HIAA来自Ac‐ros organics公司；5-HT来自Alfa Aesar公司；甲醇（色谱纯）来自Merck公司；其他试剂均为市售分析纯。

　　1.3实验仪器

　　主要仪器有高效液相色谱-荧光检测仪（日本Shimadzu公司），其组成为LC-20A输液泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、CBM-20A系统控制器、Labsolutions工作站等；Synergy HT多功能微孔板检测系统。

　　1.4血清学指标和MAO活性的测定

　　造模14 d后，测定大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（alanine amino transferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino transferase,AST）活力。其测定方法按照各试剂盒说明书进行。肝脏线粒体的提取和MAO活性的测定参考之前相关研究[5]。肝脏先用320 mmol/L蔗糖溶液匀浆，两次离心后，用25 mmol/L磷酸钾缓冲液重悬，得到肝脏线粒体。肝脏线粒体中加入0.02 mol/L的5-HT和反应试剂进行反应，用于测定MAO-A的活性；另一份肝脏线粒体中加入0.016 mol/L的苄胺和反应试剂进行反应，用于测定MAO-B的活性。最终反应物均用紫外-可见分光光度计检测溶液吸光度值，检测波长分别为425 nm和465 nm。

　　1.5血清素及其相关物质的测定

　　高氯酸沉淀剂：由0.35 M高氯酸、1.5 mM半胱氨酸和超纯水配成。

　　血浆样本的处理：50μl血浆样品加入干净的1.5 mL Eppendorf（EP）管中，加入250μl上述高氯酸沉淀剂，涡旋混匀后，静置10 min，18 000 rpm离心10 min后，移取上清200μl于干净的1.5 mL EP管中，18 000 rpm离心10 min后，移取上清于干净的进样瓶中待测。整个处理过程处于冰浴或者4℃的环境中。

　　组织样本的处理：约50 mg脑组织（皮层、海马和纹状体）于干净的2 mL EP管中，加入450μl高氯酸沉淀剂，用高速组织匀浆机将组织匀浆，静置10 min。后续步骤同“血浆样本的处理”。

　　标准曲线的制备：用甲醇溶液配制高浓度混合标准溶液（Trp：80 000 ng/mL；5-HT：8 000 ng/mL；5-HIAA：8 000 ng/mL；5-HTP：8 000 ng/mL）母液。将母液梯度稀释成以下范围的混合标准溶液（Trp：0、312.5~80 000 ng/mL，5-HIAA：31.25~8 000 ng/mL，5-HTP：15.6~8 000 ng/mL，5-HT：31.25~8 000 ng/mL）。取上述混合标准溶液10μl于干净的1.5 mL EP管中，加入90μl高氯酸沉淀剂，涡旋混匀。后续步骤同“血浆样本的处理”。

　　色谱条件参考相关研究[11]。流动相为磷酸盐缓冲液（50 mmol/L KH2PO4和0.08 mmol/L EDTA）∶甲醇=88∶12（v∶v）；流速为1 mL/min；检测器的激发波长和发射波长分别为290 nm和330 nm；进样量为20μl。

　　1.6统计方法

　　采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行处理。肝损伤指标、肝脏MAO酶活性、5-HT及5-HT相关物质浓度为计量资料，经Shapiro-Wilk检验满足正态分布，用(±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1两组肝损伤指标与肝脏MAO酶活性比较

　　两组大鼠体质量相比，差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组相比，胆管结扎组大鼠肝脏质量增加，AST与ALT水平升高，MAO-A与MAO-B酶活性降低，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1。

　　2.2两组大鼠脑和血浆中5-HT及相关物质浓度比较

　　与假手术组相比，胆管结扎大鼠皮层和纹状体中Trp、5-HT和5-HIAA均增加，血浆中的5-HTP含量增加，差异有统计学意义（P均<0.05）。见图1。

　　3讨论

　　胆管结扎引起大鼠的肝性脑病已经有多篇文献报道，包括精神异常、脑内药物转运体的改变等[1,12]。团队前期研究已经证明胆管结扎大鼠精神状态异常，皮层多巴胺含量显著增加，并对其机制进行了研究[5]。据此，猜想5-HT的代谢也可能发生紊乱。有关在肝损伤患者脑内5-HT水平的改变已有报道。BORG J等[13]报道了肝性脑病患者脑脊液5-HT含量显著升高。在肝损伤模型动物中也有类似报道。如TIAN B等[14]报道胆管结扎大鼠的皮肤和脊髓中5-HT含量显著性增高。为了验证猜想，进行了相关实验。

　　大鼠模型建立后，测定大鼠体质量、肝质量、ALT和AST活力，发现胆管结扎不会影响大鼠体质量，但显著增加肝脏质量，提示肝脏出现异常，说明胆管结扎成功引起大鼠的肝脏损伤。而ALT和AST活力作为公认的肝损伤指标，其活力分别增加3.2倍和2.3倍，验证了肝损伤的发生，说明模型建立成功。

　　随后，对大鼠各脑区和血浆中的5-HT和相关物质的浓度进行测定，以期证明5-HT的紊乱。通过上下游相关的物质的监测，推测发生紊乱的可能原因。结果发现不同脑区的浓度变化不尽相同。与假手术组相比，5-HT仅在皮层和纹状体中上调，而其合成物质来源，Trp上调，其下游代谢产物5-HIAA也上调（P均<0.05）。提示5-HT在皮层和纹状体中的显著上调可能与合成来源增加有关。与文献结果类似，YANG H等[12]发现5-HT在皮层是显著性上调的，ZHENG X等[15]发现Trp在皮层和海马均上调。在外周血浆中的研究表明，5-HTP的浓度显著性升高，这些改变的生理学意义有待研究。

　　上述研究表明除海马组织外，5-HT及其相关物质在不同脑区和外周血浆中均有改变，且改变程度不同。为了初步探索其原因，选择5-HT的主要代谢酶——MAO进行研究。之前相关研究已经表明，MAO-A和MAO-B的活性在脑内是显著下调的，提示5-HT在脑内的代谢可能是减弱的[5]。因此，本实验增加了对肝脏MAO活性的研究，发现MAO-A和MAO-B的活性在肝脏中分别下调为假手术组的71%和69%。而MAO活性的改变可能引起外周系统5-HT的代谢紊乱，具体的生物机制还有待进一步研究。

　　综上所述，5-HT及相关物质在胆管结扎14 d大鼠脑内和血浆中确实发生了不同程度的改变，纹状体中5-HT的水平改变最为明显，其原因可能与合成增加和代谢减慢有关，但具体机制仍有待深入探索。

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