[摘要]目的利用孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）方法，深入探讨41种炎症细胞因子与心力衰竭（heart failure,HF）之间的双向因果关系。方法从大规模全基因组关联研究（genome wide association study,GWAS）数据库中提取了与41种炎症细胞因子密切相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）作为研究的工具变量，HF的GWAS汇总数据来自“心力衰竭治疗靶点分子流行病学”联盟进行的最大规模荟萃分析，参与研究的对象招募时间为1948—2020年。采用逆方差加权法（inverse variance weighted,IVW）、MR Egger法以及加权中位数法（weighted median estimator,WME）3种方法进行MR分析，其中IVW作为主要方法。并使用比值比（odds ratio,OR）作为评价指标。为确保结果的稳健性，本研究行了多项敏感性分析：利用Cochran Q检验评估各SNP之间的异质性；通过MR-Egger截距测试检验SNP的水平多效性；使用MR-PRESSO检测多态性残差与离群值；最后采用“留一法”进行敏感性分析，以检验单个SNP对整体结果的影响。结果IVW结果显示，干扰素γ诱导蛋白10（interferon-inducible protein 10,IP10）与HF风险存在显著关联（OR=1.071，95%CI：1.021~1.121，P=0.003），而HF可能导致血液中白细胞介18（interleukin-18,IL-18）水平降低（OR=-0.348，95%CI：-0.711~-0.057，P=0.022）。Cochran Q检验、MR-PRESSO检验以及MR Egger截距测试的结果显示工具变量之间不存在异质性及水平多效性。“留一法”敏感性分析显示，单个SNP对整体结果没有显著影响。结论IP10可能作为一个重要的上游调节因子，在HF的发生和发展过程中起到了推动作用。IL-18则更可能是心力衰竭的一个下游效应因子。此外，并未发现其他单一生物标志物与HF之间存在显著的反向因果关系。

　　[关键词]炎症细胞因子；心力衰竭；孟德尔随机化研究

　　心力衰竭（heart failure,HF）是一种复杂的临床疾病，其特征在于心脏结构或功能障碍，导致心脏无法泵出足够的血液以满足机体需求[1]。由于全球人口老龄化等因素的影响，其患病率正在逐年增加[2]。研究表明，HF的发展过程涉及多种炎症介质，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素1（interleukin 1,IL-1）家族（包括IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-33）、白细胞介素6（inter⁃leukin 6,IL-6）、白细胞介素8（interleukin 8,IL-8）和C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）等[3-4]。尽管针对这些细胞因子的药物在既往研究中被广泛探索，但大多数三期临床试验的结果却并不理想，甚至有负面结果[5-6]。因此，炎症细胞因子的变化究竟是HF的诱因还是结果成为一个关键问题。如果这些炎症介质是疾病的后果而非起因，那么单纯的抗炎治疗可能无法达到预期效果。识别并针对诱导HF发生的上游炎症介质进行干预，才是实现有效临床治疗的关键。然而，传统的观察性研究容易受到反向因果关系和各种混杂因素的干扰，因果推断能力有限，多种炎症细胞因子与HF之间的因果关系仍存在争议。

　　孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）是一种基于全基因组关联研究（genome wide associa⁃tion study,GWAS）数据的新型流行病学方法，通过利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymor⁃phism,SNP）作为工具变量，评估遗传变异与目标结局之间的因果关联。鉴于基因随机分配的特性，该方法不易受到混杂变量和反向因果关系的影响[7-8]。本研究从已发表的41种炎症细胞因子的GWAS汇总数据中提取有效的遗传变异，并将其作为工具变量，探讨它们与HF的双向因果关系。

　　1资料与方法

　　两样本MR研究需要满足以下3个假设[7]：①相关性假设：遗传变异必须与暴露强相关；②独立性假设：遗传变异必须独立于混杂因素；③排他性假设：遗传变异只通过暴露而不是通过其他途径影响结果。见图1。

　　1.1资料来源

　　此MR分析中使用的暴露和结局数据集均来自公开可用的GWAS数据，数据来源于IEUOpen GWAS数据库网站（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）。与炎症细胞因子相关的SNP来自对8 293名个体的研究，其中包括41种细胞因子和生长因子[9]。HF的汇总统计数据来自“心力衰竭治疗靶点分子流行病学联盟”进行的最大规模的欧洲人群GWAS荟萃分析，其中包括47 309名病例和930 014名对照[10]，参与研究的对象招募时间为1948—2020年。为了防止人群分层偏差混淆研究结果，本研究中所有SNP及其随附的汇总数据均仅限于欧洲血统人群。

　　1.2工具变量的选择

　　本研究设定的基因组范围显著性阈值为P<5×10-6，以筛选与炎症细胞因子高度相关的SNP[11]。

　　为避免连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）对分析结果的影响，设置的参数为r²<0.001，kb=10 000[12]。为了确保工具变量与暴露变量之间的强关联，通过每个SNP的R²值计算暴露的方差比例，并使用F统计量评估工具变量的强度。F统计量大于10表示工具变量与暴露变量之间具有强关联性[13]。R2和F统计量的计算公式如下（MAF，最小等位基因频率；β,因果效应的估计值；SD，标准差：N，样本量；k，工具变量的数量）：
       

　　为减少偏倚和干扰，提高分析的可靠性，本研究剔除了回文SNP。同时为了确保所纳入的SNP仅通过暴露影响结局，使用http://phenoscanner.med⁃schl.cam.ac.uk数据库网站筛选与SNP显著相关的表型，剔除多效性SNP[14]。

　　1.3统计方法

　　1.3.1元分析

　　本研究采用逆方差加权法（inverse variance weighted,IVW）作为主要分析方法，并使用随机效应模型。此外，基于Egger回归的孟德尔随机化方法（mendelian randomization egger regression,MR-Egger）和加权中位数法（weighted median esti⁃mator,WME）用于补充分析，以增强结果的稳健性。因果效应的评估使用比值比（odds ratio,OR），并附带95%的置信区间（95%CI）。

　　1.3.2敏感性分析

　　Cochran's Q检验用于评估各SNP之间的异质性；MR-Egger截距检验（MR-Egger Intercept Test）和孟德尔随机化多效性残差和异常值检验（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier,MR-PRESSO）用于检测水平多效性是否存在。“留一法”敏感性分析用于评估结果是否受单个SNP的影响。本研究的所有分析均使用R版本4.3.1中的“TwoSampleMR”软件包进行。

　　2结果

　　2.1炎症细胞因子对HF的因果影响

　　显著水平P<5×10-6下，所有41种炎症因子对HF的影响。见图2A。IVW方法显示，干扰素γ诱导蛋白10（interferon-inducible protein 10,IP-10）水平升高与HF风险存在显著因果关联（OR=1.071，95%CI：1.021~1.121，P=0.003）。MR-Egger和WME分析结果与IVW方法一致。Cochran's Q检验显示结果无显著异质性；MR-Egger截距检验和MR-PRESSO方法显示不存在水平多效性；留一法也未发现离群值。见表1。

　　虽然初步MR分析显示，巨噬细胞炎性蛋白-1β（macrophage inflammatory protein-1 Beta,MIP-1β)与HF风险相关（OR=1.028，95%CI：1.001~1.056，P=0.039），但在排除了具有潜在多效性的SNP（rs113010081）后，对剩余14个SNP进行分析，MIP-1β与HF风险不再具有相关性（OR=1.021，95%CI：0.986~1.057，P=0.235）。

　　2.2 HF对炎症细胞因子的因果影响

　　在显著水平P<5×10-8下，HF对所有炎症性细胞因子的影响见图2B。IVW方法表明，HF与IL-18

　　水平的升高呈负相关（OR=-0.348，95%CI：-0.711-0.057，P=0.022）。Cochran's Q检验显示结果无显著异质性。MR-Egger截距检验和MR-PRESSO显示未观察到显著的水平多效性，留一法也未发现离群值。见表1。

　　3讨论

　　炎症被认为通过多种机制促进HF的发生和发展，全身炎症的激活表现为HF患者血液中各种标志物水平的升高。然而，鉴于HF本身引起的血液循环动力学压力可能会诱发无菌炎症反应[15]，至今尚不明确炎症生物标志物水平的变化是其参与HF发生机制的反映，还是仅仅是HF的附生现象。传统观察性研究容易受到混杂因素和反向因果关系的影响，限制了因果关系的确立。MR研究由于遗传变异的随机性和工具变量的独立性，提升了因果推断的准确性[16]。本研究发现，当白细胞介素和趋化因子作为暴露变量、HF作为结局时，结果表明IP-10可能是HF的上游调节因子。反之，若HF作为暴露变量，则可能通过致病途径导致IL-18水平下降。未发现单一生物标志物与HF之间存在反向因果关系。

　　IP-10是一种由T淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞等多种细胞合成的趋化因子。Leavitt C等[17]的前瞻性队列研究发现，IP-10水平升高与HF发生风险和全因病死率之间存在显著关联，并且这种关联独立于传统心血管疾病风险因素，这与通过MR分析得出的结论一致。IL-18是IL-1细胞因子家族的一员，由免疫细胞、内皮细胞和心肌细胞等多种细胞产生。流行病学研究显示，IL-18在心血管疾病的发生和进展中扮演重要角色，血液中IL-18水平升高与多种心血管疾病风险增加密切相关[18]。然而，近期两项MR分析结果显示，IL-18与心血管疾病风险（包括HF）之间不存在因果关联[19]。本研究发现，IL-18并不是导致HF的风险因素，而是HF发展的下游结果。因此，针对IL-18的治疗可能无法有效预防疾病的初期发展。尽管在大量的前瞻性研究结论中，循环IL-6，TNF-α和IL-1等炎症细胞因子水平与HF风险相关[20-21]，但MR结果并未发现它们之间的因果关联，这也与最近的MR研究结论一致[22-23]。从临床角度来看，HF患者的异质性可能影响了细胞因子与HF之间的关系。由于HF的病因、病程和预后存在个体差异，因此在大规模人群中或难以观察到一致的关联。此外，考虑到HF的疾病进程的动态性。HF是一个不断发展的过程，细胞因子水平可能随着疾病阶段的变化而变化[24]。因此，单次测量的细胞因子水平可能无法全面反映其与HF间的长期关系。

　　综上所述，本研究通过MR分析，IP10在HF发生和发展中可能扮演着重要的上游调节角色，而IL-18更可能是HF进展的一个下游效应因子。

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