摘要：目的探讨去氢骆驼蓬碱抗骨肉瘤的作用机制。方法本实验分为体外实验和体内实验。体外实验中，设置不同浓度的去氢骆驼蓬碱组及空白对照组，测定去氢骆驼蓬碱对处于生长期的人骨肉瘤细胞的影响：借助细胞活力测定（MTS）法对细胞增殖的影响进行探讨；通过划痕实验分析去氢骆驼蓬碱的侵袭能力，通过Transwell实验分析去氢骆驼蓬碱的迁移能力；应用流式细胞仪（FCM）分析去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤细胞周期的影响，并观察其中的诱导凋亡效应及相关分子机制。体内实验开展裸鼠荷瘤实验，实验完毕后，比较肿瘤的重量、裸鼠的重量，并进行免疫组化切片对肝、肺、脾进行HE染色，观察其中的抗肿瘤效果。结果体外实验表明，去氢骆驼蓬碱对细胞增殖具有一定的抑制效果（P<0.05），且去氢骆驼蓬碱组的抗凋亡基因相对表达量、相对迁移能力以及侵袭能力明显低于空白对照组（P<0.05）。FCM分析显示，随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加，凋亡率也明显增加（P<0.05）。体内实验表明，去氢骆驼蓬碱能够明显抑制Saos-2移植瘤。结论去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭有明显的抑制作用，具有较高的应用价值，值得临床推广。

　　关键词：去氢骆驼蓬碱；抗骨肉瘤；作用机制；细胞迁移；细胞凋亡

　　0引言

　　骨肉瘤是临床常见的原发性恶性肿瘤，高发于儿童与青少年。就目前而言，复发、转移及耐药性是骨肉瘤治疗的三大重点，在患者围术期进行化疗能有效提高患者的生活质量。去氢骆驼蓬碱是近几年来出现的抗癌药物，作为一种天然的β-咔啵啉类生物碱，有着较为广泛的药理作用，会对心血管、中枢神经、肌肉等通道产生作用，但对于骨肉瘤的作用机制尚不清楚。去氢骆驼蓬碱广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物、人体组织当中，具有一定的抗肿瘤、抗氧化、抗细菌作用。可是，有关去氢骆驼蓬碱的抗肿瘤作用机制的研究具有一定的局限性，大多是从一个方面对其进行研究。基于此，本研究从多个方面探讨去氢骆驼蓬碱的抗骨肉瘤作用机制，具体报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料
       1.1.1细胞系

　　本研究选择的细胞系为骨肉瘤细胞系Saos-2（武汉大学培养物中心），并在实验室中保存备用。

　　1.1.2试剂与耗材

　　实验药物及设备：①去氢骆驼蓬碱购自上海源叶生物有限公司，使用二甲亚砜(DMSO)将浓度控制在200mmol/L，在零下温度避光保存[1]；②DMEM（细胞培养基）、胎牛血清购自郑州九龙生物制品有限公司；③PCR引物（上海英杰生物技术有限公司）、逆转录试剂盒（Thermo公司）、RNA提取试剂盒（Invitrogen公司）、Real-time PCR反应试剂（北京TaKaRa公司）[2]；④一抗、二抗均购自CST公司；⑤电泳液（北京索莱宝生物有限公司）、培养板、Transwell系统（康宁公司）、基质胶（BD公司）；⑥显微镜（Olymlpus公司）、HFsafe1200超净工作台（力申科学仪器公司）、培养箱（Heraeus公司）、精密电子天平（上海精密科学仪器公司）、微型离心机（Heraeus公司）、凝胶自动成像仪（Bio-Rad公司）、全自动超纯水机（Millipore公司）、电泳仪（Bio-Rad公司）、PCR仪（ABI公司）[3]。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞的活力测定

　　首先，进行细胞复苏、细胞培养以及细胞冻存。细胞活力测定(MTS)法是检测细胞存活、生长的常见方法，原理为活细胞会还原四唑盐，并在细胞内形成蓝紫色的沉淀，而已经死亡的细胞是无法进行还原的，溶液颜色与蓝紫色产物的量成正比。

　　随后，使用酶标仪测量其中的光密度（OD）值，将其与MTS沉淀量比例结合起来进行分析。取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液，将浓度调整到5000/孔，于恒温下进行过夜培养；从96孔培养箱中取出，随后将不同浓度的去氢骆驼蓬碱接种于各孔，于CO2培养箱中再次进行培养，计算细胞存活率[4]。

　　1.2.2 Real-time PCR实验

　　将骨肉瘤细胞Saos-2于6孔板中接种，在恒温箱中培养，以探讨去氢骆驼蓬碱在细胞凋亡中的作用机制；基于不同浓度的去氢骆驼蓬碱（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L），每天换1次培养液，到48h后使用Trizol试剂对细胞液进行裂解，提取总RNA；使用0.5μg总RNA于逆转录合成dDNA；使用Real-time PCR仪器对基因扩增情况进行检测；将GAPDH当作内参基因，比较基因表达情况[5]。

　　1.2.3细胞凋亡试验

　　接种Saos-2细胞于96孔板当中，放于恒温培养箱中进行过夜培养；分别对浓度不同的去氢骆驼蓬碱（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）进行干预，使用浓度为70%的冷乙醇进行培养，使用PBS无菌液洗涤；在浓度为1mg/mL、温度为37℃的条件下，使用胰蛋白酶消化30min，固定并染色20min，计算细胞凋亡率[6]。

　　1.2.4划痕实验及Transwell实验

　　Transwell实验也称为Transwell迁移或侵袭测定实验，是一种用于细胞生物学和分子生物学的实验室技术，用于研究细胞通过多孔膜的运动。取对数生长期Saos-2骨肉瘤细胞，使用PBS无菌液对其进行冲洗，去除残留的培养基，并用含有EDTA且浓度为0.25%的胰蛋白酶进行消化，使用微型离心机开展细胞离心处理，随后对细胞进行二次悬浮计数[7]；将细胞接种于24孔板中，密度为100000/孔，放入恒温培养箱中进行培养，可在一夜后进行黏附；24孔板细胞密度到80%后，于黄色尖端处进行标记，并通过PBS无菌液对角质细胞进行清洗；每12h对不同浓度的去氢骆驼蓬碱（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）治疗下的划痕宽度进行观察[8]。当对照组的划痕愈合之后，结束实验，并抽取3个点进行观察，分析划痕宽度的变化，计算迁移率。迁移率=［（平均初始宽度-平均最终宽度）/平均最终宽度］×100%[9]。

　　1.2.5裸鼠荷瘤实验

　　首先，使用Saos-2细胞于裸鼠的肩部与脾脏部位分别接种浓度为25mg/kg及50mg/kg的去氢骆驼蓬碱，观察细胞增殖率；随后进行TUNEL免疫染色，观察两组细胞凋零水平。

　　研究结果表明，空白对照组的细胞增殖率明显低于25mg/kg及50mg/kg浓度组。进行TUNEL免疫染色后发现，凋亡水平有明显的增加。

　　1.3统计学方法

　　本研究所涉及的统计学数据资料均利用SPSS 21.00软件进行处理计算，其中计量资料采用t检验，以（x—±s）表示；计数资料采用χ2检验，以[n（%）]表示；以P<0.05代表差异具有统计学意义[10]。

　　2结果

　　2.1去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

　　本次研究结果表明，去氢骆驼蓬碱组的Saos-2细胞增殖明显（P<0.05）；且随着浓度的增加，Saos-2细胞增殖明显降低（P<0.05），如图1所示。

　　2.2去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤细胞凋亡的影响

　　研究结果表明，相较于空白对照组，去氢骆驼蓬碱组的Saos-2凋亡率更高，且随着去氢骆驼蓬碱浓度的升高，Saos-2凋亡率也随之增高（P<0.05），当浓度达到20μmol/L后，凋亡率接近100%，如图2所示。

　　实验结果显示，OD值随着去氢骆驼蓬碱浓度的升高在不断增加（P<0.05），见表1。

　　其次，通过流式细胞仪（FCM）对不同浓度的去氢骆驼蓬碱进行分析，在培养48h时，G0-G1周期中，随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加，细胞明显增加；G2-M周期中，随着浓度的增加，细胞明显降低；S周期呈不规律变化。凋亡率随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加而增加，说明去氢骆驼蓬碱对细胞凋亡有促进作用，见表2。

　　2.3去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤细胞迁移能力的影响

　　相较于空白对照组，去氢骆驼蓬碱组的Saos-2迁移距离明显降低（P<0.05）。在Transwell实验中发现，Matrigel基质胶具有生物学功能，在不同浓度的去氢骆驼蓬碱下，细胞穿透Matrigel基质胶的能力都出现下降趋势，如图3所示。

　　2.4裸鼠荷瘤实验结果探究

　　荷瘤成功后，通过比较肿瘤重量、裸鼠重量、免疫组化切片以及裸鼠肝、肺、脾部HE染色，探究去氢骆驼蓬碱应用于小动物后的抗肿瘤效果[11]。根据实验结果可以看到，随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加，Saos-2细胞增殖明显降低，Saos-2凋亡率也随之增高，同时其迁移逐步下降。

　　3讨论

　　骨肉瘤是临床常见的原发性恶性肿瘤，高发人群为青少年，对青少年的身心健康造成了很大的威胁。该疾病临床表现为关节持续性隐痛、肿块等。另外，发热、咳血、呼吸困难、贫血等症状也是骨肉瘤的常见并发症，大部分患者的病灶部位是膝关节周围，且可以通过手术治疗、化疗等方式痊愈。近年来，抗肿瘤药物的出现为骨肉瘤的治疗提供了新思路。许多研究都表明，骨肉瘤的治疗率明显提高，但是骨肉瘤作为原发性恶性肿瘤，会出现转移的情况。因此，骨肉瘤的治疗仍是一个较大的难题，且控制骨肉瘤细胞增殖依然是治疗的主要目标，迫切需要找到一种新型有效的治疗骨肉瘤的药物。

　　近年来，国内外的许多研究逐渐重视植物源性药物对该疾病的医用价值，如红豆杉的代谢产物紫杉醇就对恶性肿瘤有着较高的应用价值，在临床上也有着广泛应用。因植物源性药物的来源较为广泛，成本较低，产生的副作用较小，可能会在日后成为潜在的重要研究靶点。当前，大部分关于去氢骆驼蓬碱药物的研究都局限于体外研究，虽然能够产生较高的疗效，在抑制肿瘤细胞增殖的同时促进细胞凋亡，但是其中的分子机制还需要进一步探讨。

　　本文基于此选择去氢骆驼蓬碱作为治疗药物，分析了去氢骆驼蓬碱在骨肉瘤治疗中的作用机制。首先，在细胞增殖中发现，随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加，骨肉瘤细胞Saos-2增殖率明显降低，两者呈负相关。在细胞凋亡实验中发现，随着去氢骆驼蓬碱浓度的增加，骨肉瘤细胞Saos-2的凋亡率明显增加，两者呈正相关。FCM分析中，G0-G1周期中随着去氢骆驼蓬碱浓度增加，细胞明显增加；S周期中随着去氢骆驼蓬碱浓度增加，细胞呈不规律变化；G2-M周期中随着去氢骆驼蓬碱浓度增加，细胞明显减少且凋亡率明显增加。划痕实验及Transwell实验表明，相较于空白对照组，去氢骆驼蓬碱组的Saos-2迁移距离明显降低（P<0.05）。在裸鼠荷瘤实验中，随着去氢骆驼蓬碱接种浓度的增加，细胞增殖率降低；且在TUNEL免疫染色后发现，随着去氢骆驼蓬碱接种浓度的增加，细胞凋亡水平明显增加。

　　4结论

　　综上所述，去氢骆驼蓬碱对骨肉瘤的细胞增殖具有抑制作用，可促进细胞凋亡，因此可作为骨肉瘤治疗的潜在靶点。

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