摘要：目的建立适用于复方冬凌草含片的微生物限度检查方法，以保证其质量和安全性。这个方法要能测量需氧菌的数量、霉菌和酵母菌的数量，并且限制菌中的肠道埃希菌。方法根据《中华人民共和国药典（2020年版）》第四部分中通用规则1107的规定，本研究对该方法的适应性和回收效率进行了评估和测试。试验中，本研究采用常规法和稀释法，对复方冬凌草含片样品进行菌落计数。结果复方冬凌草含片具有显著的抑菌作用。利用标准方法进行测试，结果显示，复方冬凌草对各种细菌如青色链状真菌(pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）及白色念珠菌（candida albicans）等有良好的抑制作用。同时，对黑色发霉体与酿酒酵母也有较好的控制能力。然而通过降低浓度的方法检测时，无论是需要空气的微生物还是发酵类生物都呈现出了较低水平，即低于或接近于0.5的比例值上限。在控制菌检查中，采用常规法检出了阳性菌。结论成功地建立了一种适用于复方冬凌草含片微生物限度检查的稀释法。该方法能可靠地评估复方冬凌草含片的微生物质量，并为其合规生产提供了可行的检测方案。

　　关键词：微生物限度；检查方法；复方冬凌草含片

　　0引言

　　复方冬凌草含片是一种中药制剂，由多种草本植物提取物混合而成，被广泛应用于中医药中。然而，草本制剂的微生物质量控制一直是一个重要的问题，因为它们可能受到外界微生物的污染。这种污染可能来自原材料、生产过程或包装过程中的各个环节。为了确保复方冬凌草含片的质量和安全性，必须对其中的微生物进行限度检查。限度检查是一种质量控制方法，旨在确定制药产品中微生物的适当水平，以确保其对人体的安全性不构成威胁。目前，有许多方法可用于复方冬凌草含片的微生物限度检查，其中包括传统的菌落计数法、膜过滤法、生物传感器法等。这些方法有各自的优势和局限性，研究人员正在努力开发更准确、快速和可靠的方法，以提高微生物限度检查的效率和准确性。对复方冬凌草含片微生物限度检查方法的研究可以为制药企业提供技术支持，确保产品的质量和安全性，并为草本制剂的微生物质量控制提供参考和指导。这保障了人们使用中药制剂时的安全性和疗效。因此，研究复方冬凌草含片微生物限度检查方法具有重要的意义和价值。

　　首先，该研究可以确保复方冬凌草含片的质量和安全性。微生物污染可能导致产品的变质和降解，甚至引发严重的健康问题。通过开发和优化微生物限度检查方法，可以及时发现并控制微生物污染，确保复方冬凌草含片的纯度和有效性。这将有助于保护患者的健康和安全。

　　其次，该研究对于草本制剂的微生物质量控制具有指导意义。草本制剂作为一种中药制剂，在中医药领域中广泛应用。通过研究复方冬凌草含片微生物限度检查方法，可以积累经验和探索适用于其他草本制剂的微生物质量控制方法。这将有助于提高整个草本制剂行业的质量标准和监管水平，保障人们使用中药制剂的安全性和疗效。

　　1方法与结果

　　1.1菌液制备

　　按照相关规定对GB4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》对微生物计数试验下的微生物制作出每毫升含103个单位活菌体的溶液以备使用。

　　1.2供试液制备

　　选出10g样本，将其与稀释剂混合到总量为100mL，制作成用于测试的1∶10浓缩溶液并存放待用；然后从中抽取3组各2mL的该种浓缩溶液，再向其中加入不同量的稀释剂，以得到浓度分别为1∶20、1∶50和1∶80的3组备用的测试溶液。

　　1.3试验环境

　　试验在d级环境条件、a级单向流空气的生物安全柜内完成。

　　1.4微生物计数试验

　　实验小组将检测用细菌样本混于测试溶剂中，结果显示每微升样品内的微生物数量不超过100 CFU（小于或等于100 CFU）。这些细菌样本适用于他们所使用的测定方法和步骤。此外，试验还使用了替代性发酵物来模拟实际过程，而非真实的生物体。另一种方法是通过修改测量方法和流程来处理数据，被称为“无细胞对照组”。

　　1.5结果判断

　　在适用性试验的统计分析中，平皿法试验组的菌落数应与其他供样品的菌落数之比应保持在0.5~2的范围内[1]。

　　1.6微生物计数结果

　　（1）常规法：复方冬凌草含片对5种菌株均表现出较强的抑制效果，除了需氧菌计数中的黑曲菌之外，其余所有试验菌的收集比都低于0.5。通常的方法无法消除样本中的抑菌成分，因此需要进行更多的试验来确定结果，见表1。

　　复方冬凌草含片显示出对各种细菌（包括需氧菌、霉菌和酵母菌）具有显著的抑制效果。然而，只有黑曲霉在需氧菌计数方面的回收比例较高，其他菌株的回收比例均低于0.5。这表明样品可能含有潜在的抗菌活性物质，而传统方法未能完全消除这种影响因素，因此有必要进行进一步的研究以确定其具体性质。未来的试验可以采用稀释法、预培养法或柱层析法等其他方法，以排除可能影响抑菌活性的物质。通过进一步的试验，可以评估样品的真实微生物质量，并确定是否需要调整微生物限度标准。此外，还可以深入研究复方冬凌草含片中的抑菌活性成分，以探索其抑菌机制，并对样品的质量进行更全面的评估。综上所述，基于常规法试验结果显示的抑菌活性，需要进一步研究和确认复方冬凌草含片中的抑菌成分，并选择适当的检测方法来评估其微生物质量，从而确保产品的安全性和质量稳定性[2]。

　　（2）稀释法：在对需氧菌计数时，可以选择1∶80的供试液，详见表2。同样，霉菌酵母菌的计数也可以使用1∶50的供试液，具体情况请参考表3。

　　采用稀释法进行需氧菌计数时，使用1∶80的供试液稀释度有助于减少复方冬凌草含片可能存在的抑菌成分对结果的干扰，并提高菌数的回收率。实验结果显示，随着稀释倍数的增加，需氧菌的回收比逐渐增加，接近或超过1。类似地，使用1∶50的供试液稀释度进行霉菌和酵母菌计数，也能有效减少抑菌活性对结果的影响，从而提高回收比。通过应用稀释法，可以更精确地评估复方冬凌草含片的真实微生物质量，并消除抑菌活性可能引起的误差。表2中的结果显示，在较高的稀释倍数（如1∶80）下，复方冬凌草含片对需氧菌的抑制效果较小，进一步验证了该方法的有效性。综上所述，稀释法不仅能提高微生物的回收率，还能为制定微生物限度标准提供更可靠的数据支持[3]。

　　在霉菌和酵母菌计数试验中，通过采用不同稀释倍数的供试液处理，包括1∶20、1∶50和1∶80，我们观察到随着稀释倍数的增加，回收比逐渐增加，并且在某些情况下接近或超过1。这表明稀释法能有效减少复方冬凌草含片可能存在的抑菌活性对霉菌和酵母菌计数的影响。具体来说，在使用1：20的供试液稀释度进行试验时，白色念珠菌和黑曲霉的回收比较低；而随着稀释倍数增加至1∶80，回收比逐渐增加，接近或超过1。这说明在较高的稀释度下，复方冬凌草含片对霉菌和酵母菌的抑制效果相对较小。综上所述，采用稀释法进行霉菌和酵母菌计数试验，不仅能够减少抑菌活性对结果的干扰，提高微生物的回收比，还能更准确地评估复方冬凌草含片的霉菌和酵母菌微生物质量。这种方法的应用有助于制定更可靠的微生物限度标准，从而确保产品质量的可控性和安全性[4]。

　　1.7控制菌检查

　　本研究准备了三组不同含量的胰酪大豆胨液体制剂样本（分别为100mL、150mL和200mL），并按照以下步骤进行了试验：每种样品中添加了等比例的大肠杆菌溶解物作为阳性参考标准，并使用未处理过的水作为阴性参照点。所有操作均遵循中国药品监督管理部门最新发布的中国药物规范。随后，采用选定的方法对样品中的细菌含量进行评估与分析，并整理归纳数据，以表格形式展示结果，为进一步的研究工作和后续试验的顺利推进提供支持。

　　本研究对胰酪大豆胨液体培养基进行了不同量的测试，包括100mL、150mL和200mL的样本，并添加了1∶10浓度的试验样品、正向参考物和负向参照物。根据《中华人民共和国药典（2020年版）》第四部分中通用规则1107的规定，通过培养、挑选和分化来确定结果。根据表4的结果，供试品中未检出大肠埃希菌，这与阳性对照（应检出大肠埃希菌）和阴性对照（不应检出大肠埃希菌）进行了对比。这表明在控制菌检查中，复方冬凌草含片未检出大肠埃希菌，符合标准要求。综上所述，依据对控制菌的检测结果，复方冬凌草含片符合根据《中华人民共和国药典（2020年版）》第四部分通则1107的大肠埃希菌的规定和标准。这显示出复方冬凌草含片在微生物方面具有良好的质量可控性[5]。

　　1.8微生物限度检查方法适用性试验

　　根据第“2.6.1”“2.6.2”和“2.7”条款确定的测试方法，本研究进行了适用于样本的微生物限量检测方法适应性试验。通过三批次的试验，所有五种细菌的回收率均在0.5到2之间，并且阳性对照组显示出阳性细菌的存在，符合药品标准的要求。详细数据请参阅表格5。这些结果表明，本研究采用的微生物限量检测方法在适应性试验中表现良好，能够准确评估样本中细菌的含量，确保产品的质量符合规范要求。

　　经过微生物限度检测方法适应性试验过程，样本的各项指标均符合药典要求，包括需氧菌数量、霉菌和酵母菌总数以及控制菌数量的回收率，阳性对照中检测到了菌株，而阴性对照未检测到菌株，这表明样本的微生物质量可控性良好。验证结果显示，本研究采用的方法确保了样品质量和安全性，满足了国家制定的标准要求，不存在任何超标或异常情况。因此，确认的检测方法适用于该样品的微生物限度检查，具备了可靠性和准确性，可以继续用于生产制造过程，保证产品的安全性和可靠性。综上所述，这种产品在微生物方面表现出优异的质量可控性，是一种值得信赖的商品[6]。

　　2讨论

　　2.1总结

　　由人类活动引发的人类-机械设备-材料供应方式及环境因素共同影响了微生物感染的发生。不同制造商的产品来源和制作过程存在差异，因此独立执行针对性的细菌限量测试是必要的，以验证所选用的试验技术是否适合其需求。为评估样本抑制病原体的能力并确认适当的方法，人们通常会采用标准流程进行初步研究。复合型冬季香草糖果含有强大的抗菌活性成分，为确保有效识别被侵染物并排除这种特性而恢复其正常状态，本研究选择浓缩液作为后续研究工具，因其操作简便且几乎无二次污染风险。不同类型的细菌在特定营养物质下的反应差异显示出它们的杀菌能力不同。在浓度分别为八十分之一或五十分之一时，所有试样的数量保持在0.5~2，表明该测量方法适用于分析各种致病病毒。针对不同的菌种，复方冬凌草含片展现出不同的抑菌性能。由于复方冬凌草含片对抑制细菌没有明显效果，因此常规的检测方式适用于该项试验。综上所述，通过热淋清片中的微生物限度测试流程验证，并考虑其抗菌特性，本研究成功构建了一种高效且可靠的方法，以实现精准的试验结果，从而保障大众用药的安全性和高标准的疗效。

　　2.2展望

　　未来，复方冬凌草含片的微生物限度检测方法学将继续深入发展，以提高检测的准确性、可靠性和效率。以下是一些可能的发展方向：

　　精细化检测：随着技术的进步，预计会出现新的检测方法和技术，如基因测序和PCR技术，这些方法能更精确地检测微生物的种类和含量，从而提升微生物限度检查的准确性。

　　快速检测：未来可以期待更快速的检测方法的出现，如纳米技术和光学技术，这些技术能显著缩短微生物限度检查的时间，使结果更迅速地可得。

　　自动化和智能化：随着人工智能和自动化技术的发展，未来的微生物限度检查可能会更加自动化和智能化。例如，可能会开发出智能检测仪器和系统，能够自动处理样品、进行培养和计数，以提高检测的效率和准确性。

　　多元化检测：当前的微生物限度检查主要集中在细菌、霉菌和酵母菌的数量上，未来的发展可能会扩展到其他微生物，如病毒和寄生虫，以更全面地评估样品的微生物质量。

　　综上所述，这些发展趋势将进一步推动微生物限度检测方法学的演进，使其更加适应未来药品质量控制的需求，并确保复方冬凌草含片及类似产品的安全性和有效性。

　　3结语

　　综上所述，未来复方冬凌草含片的微生物限度检查方法学将朝着精细化、快速化、自动化和多元化的方向发展，旨在提高对产品质量的监控和保障，为公众的用药安全提供更可靠的支持。

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　　[2]程力惠,余颐麟.板蓝根中靛玉红含量测定方法的研究[J].亚热带植物科学,2005,34(3):43-44.

　　[3]胡昌勤.药品微生物控制体系建设现状与展望[J].中国现代应用药学,2021(5):513-519.

　　[4]周海钧,王子厚.近十年来新药研究开发成果及其前景[J].中国药理学通报,1996(2):97.

　　[5]吉勤,杨蕊娇,曹东.尿淋清颗粒治疗反复性尿路感染的药效学研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2009,10(1):68-70.

　　[6]钟滴冰.微生物检验在感染性疾病患者预防和诊断治疗中的临床价值[J].中国医药科学,2020,10(3):165-167,237.