[摘要]目的探讨免疫学及分子生物学检测技术在慢性肺曲霉病早期诊断中的应用效果。方法非随机选取2020年1月—2023年8月西安医学高等专科学校附属医院收治的110例疑似慢性肺曲霉病患者为研究对象，均为其开展免疫学及分子生物学检测技术检测，以病原学检查结果为金标准，分析免疫学及分子生物学检测技术在慢性肺曲霉病早期诊断中的效果。结果分子生物学肺泡灌洗液-实时荧光定量核酸扩增检测系统（bronchoalveolar lavage fluid-quantitative real-time PCR，BALF-QPCR）对慢性烟曲霉病进行诊断的准确度为88.18%(97/110)，灵敏度为87.78%（79/90），阴性预测值为62.07%（18/29），高于免疫诊断方法的72.73%(80/110)、68.89%（62/90）、39.13%（18/46），差异有统计学意义(χ2=7.590、10.513、10.526，P均<0.05）。结论分子生物学检测技术在慢性肺曲霉病早期诊断中可取得更高的诊断灵敏度，可使慢性肺曲霉病得到有效的早期诊断。

　　[关键词]慢性肺曲霉病；早期诊断；免疫学；分子生物学；研究

　　曲霉属于自然界常见真菌，当曲霉进入到肺部后，就可能对肺部造成损伤，引发多种类型肺曲霉病，其中就包括慢性肺曲霉病。慢性肺曲霉病属于世界范围内面临的重要公共卫生问题，疾病发生后，不会导致典型症状出现，当患者患有复杂的疾病疾病时，会进一步提高慢性肺曲霉病的诊断难度。有资料显示，对于确诊为慢性肺曲霉病的患者，其在疾病确诊后的半年内的死亡率达到15%以上，尤其是慢性坏死性肺曲霉病，导致的死亡率更高，可达到50%以上。为使患者的疾病预后得到改善，就需要做好慢性肺曲霉病的诊治工作。在诊断曲霉疾病时，为使疾病得到确诊，就需要借助组织病理学来实现，但当患者的病情发展到严重阶段，或出现明显咯血症状时，肺活检存在较大的风险，在进行组织病理学检查时，约1/5会出现假阴性的情况。在对曲霉病进行诊断时，真菌抗原检测属于常用的非侵入性检查方法，且抗体检查可取得比抗原检查更好的效果。近年来，分子生物学检查手段在曲霉病的诊断中也得到越来越多的应用。本研究探讨了免疫学及分子生物学检测技术在慢性肺曲霉病早期诊断中的应用效果。现报道如下。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　非随机选取2020年1月—2023年8月西安医学高等专科学校附属医院收治的110例疑似慢性肺曲霉病患者，其中男62例，女48例；年龄22~76岁，平均（50.85±8.18）岁；病程6~18个月，平均（12.20±3.65）个月。本研究经西安医学高等专科学校附属医院伦理委员会批准（20200135），患者及家属均知情同意。

　　1.2纳入与排除标准

　　纳入标准：①疑似慢性肺曲霉病患者；②慢性肺曲霉病诊断标准；③持续存在胸部异常影像（胸部CT）；④曲霉感染的直接病原学依据或免疫学证据；⑤除外其他疾病外，症状至少存在3个月以上；⑥患者常不存在严重免疫缺陷，如HIV感染，肿瘤化疗或免疫抑制治疗。

　　排除标准：①合并其他严重肺部疾病者；②恶性肿瘤患者；③合并其他病原菌急性感染者；④合并严重免疫抑制疾病者，如艾滋病。

　　1.3方法

　　免疫学检查方法：指导患者禁食8~10 h，对肘静脉血进行采集，共采集4份，每份采集量为4 mL，以3 000 r/min速度离心15 min，离心完成后取上层血清，开展半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）、烟曲霉特异性IgM抗体、（1,3）-β-D葡聚糖（G试验）以及烟曲霉特异性IgG抗体检查。采集患者的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF），采集量需超过5 mL，以双层无菌纱布进行过滤，将肺泡液内存在的粘液去除，对总量进行记录。借助生物安全柜，向无菌离心管转移获取的BALF，放入离心机内以3 000 r/min速度离心20 min，离心温度为4℃,取上清液1.5 mL，保存待检，检测指标为半乳甘露聚糖。

　　分子生物学检测方法：采集患者的BALF，采集量需超过5 mL，以双层无菌纱布进行过滤，将肺泡液内存在的粘液去除，对总量进行记录。借助生物安全柜，向无菌离心管转移获取的BALF，放入离心机内以3 000 r/min速度离心20 min，离心温度为4℃,取少量上清液200~500μl重悬BALF沉渣，将其移入至冻存管，保存待检，进行曲霉DNA提取。应用NanoDrop2000分光光度计对DNA浓度进行测量。2次以上Ct值<35为阳性。

　　1.4观察指标

　　①以病原学检查结果为金标准，选取新鲜胸腔积液、支气管肺泡灌洗液或合格痰标本制成浮载片，显微镜下观察菌丝形态(典型形态为45°分枝的有隔菌丝)，同时接种沙堡琼脂培养基，分离和进一步鉴定菌种。分析各种免疫诊断方法（血清G试验≥100 pg/mL、血清GM试验≥0.25 ug/L、血清烟曲霉IgM抗体>31.25 AU/mL、血清烟曲霉IgG抗体<500 AU/mL则为阳性）对慢性烟曲霉病的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值预测的效果。②分子生物学肺泡灌洗液-实时荧光定量核酸扩增检测系统（bronchoalveolar lavage fluid-quantitative real-time PCR，BALF-QPCR）（2次以上Ct值<35为阳性）对慢性烟曲霉病的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

　　1.5统计方法

　　采用SPSS 25.0统计学软件处理数据。诊断效能为计数资料，以例数（n）和率（%）表示，组间比较行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　BALF-QPCR对慢性烟曲霉病进行诊断的准确度、灵敏度、阴性预测值高于免疫诊断方法，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1、表2。

　　3讨论

　　在对慢性烟曲霉病进行诊断时，血清抗原具备的灵敏度并不高。BALF-GM阳性率高，可在一定程度上反映出曲霉在患者呼吸道侵入的模式，可能对气道的菌负荷量气道间接反映的作用。但在诊断肺曲霉病的过程中，BALF-GM的应用也会存在一定局限性，比如在检测烟曲霉时，在对BALF进行采集时，目前尚未制定统一的标准流程，且灌洗操作过程也会受到操作人员自身经验的影响，从而可能影响最终BALF-GM诊断的灵敏度与特异度。血清G试验与GM试验对于慢性烟曲霉病的诊断灵敏度低，首先可能是由于慢性烟曲霉病具备相对正常的机体免疫力，在受到曲霉的侵袭后，病情并不会快速进展，疾病早期开展检查时，患者机体血液内的G与GM可能已经被清除。有资料显示，在患者机体受到曲霉侵袭的8周后，其机体血清内的GM水平呈现出逐渐降低的趋势。有研究报道称，粒缺患者由于自身机体的中性粒细胞数量降低，导致其在受到曲霉侵袭后，对于曲霉的吞噬能力减弱，呈现出较高的真菌负荷量，GM更容易向血液循环释放。然后可能和不同亚型的慢性烟曲霉病病理机制存在关联。CCPA患者在切除的空洞内，有隔膜的菌丝存在，其可能充填空洞，或导致空洞发生闭塞，且会导致慢性炎症的发生，或出现肉芽肿，不会出现肺组织被曲霉侵袭的情况。而SAIA患者的肺实质会受到菌丝的侵袭，会导致肺局部组织出现急性炎症或坏死。最后可能是受到药物使用的影响，慢性烟曲霉病在入院接受治疗时，大多已经接受过抗真菌药物治疗，药物的使用会将患者体内曲霉的增殖减少，从而使得血清内的曲霉水平降低。因此抗真菌药物治疗的开展，会将GM诊断的灵敏度以及阳性预测值降低，有研究报道称，慢性烟曲霉病在使用抗真菌药物治疗7 d后，GM诊断的灵敏度会从60%降低至53%。血清烟曲霉IgM抗体与血清烟曲霉IgG抗体的诊断灵敏度也较低，可能和SAIA自身的特点存在关联。

　　有研究报道称，对血液样本内的曲霉DNA使用PCR法进行检测，可使侵袭性曲霉病得到有效诊断。使用PCR法诊断血清曲霉感染时，灵敏度为85.8%，特异度为93.5%。本研究中，BALF-QPCR对慢性烟曲霉病进行诊断的准确度为88.18%，灵敏度为87.78%，阴性预测值为62.07%，高于免疫诊断方法的72.73%、68.89%、62.07%，表明在对肺曲霉病进行早期诊断时，分子生物学BALF-QPCR可取得较高的准确度与灵敏度。但需要注意的是，QPCR无法对定植或致病菌予以鉴别，通过将其与GM联合应用，可使假阳性情况得到有效避免。在开展QPCR检查时，假阴性的出现，主要是由于：受到肺曲霉病病理类型的差异影响，其阳性率也存在明显的差异，阳性率最高的类型为CCPA，同时CCPA患者自身的影像学进展至少已经出现3个月，随着病情发展，也更容易检测出曲霉。同时抗真菌药物的应用，也会对患者体内的曲霉产生抑制作用，减少曲霉的释放，从而影响到BALF-QPCR的检查结果。

　　综上所述，分子生物学检测技术在慢性肺曲霉病早期诊断中可取得更高的诊断灵敏度，可使慢性肺曲霉病得到有效的早期诊断。

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