摘要：目的进行核酸检测与酶免检测平行筛查血液对血站的效果探究。方法本次选取本血站中收集的无偿献血者标本15427例，各样本进行平行筛查血液操作，检测技术包括核酸扩增技术与酶联免疫法，分析检查结果。结果经酶联免疫法筛查后乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、丙肝病毒抗体（抗-HCV）、艾滋病病毒1型/艾滋病病毒2型（抗-HIV-1/2）无反应性及仅1种试剂为反应性的标本共15329例；经核酸扩增技术检测的15329例，发现阴性标本15231例，阳性标本为98例，阳性标本检出率达到0.64%；酶联免疫法检测后，开展HB-sAg、抗-HBs、抗-HBe、HBeAg、抗-HBc等筛查工作，检测有52例属于阳性标本，确认阳性率达到53.06%；通过定量检测98例核酸扩增技术检测阳性标本，结果发现有43例为HBV DNA阳性，阳性率达到82.69%（43/52），结果未发现HIV RNA阳性样本、HCV RNA阳性样本。结论在血站血液筛查中应用核酸扩增技术检测、酶联免疫法检测平行筛查，可达到两种检测手段互补的效果，及时发现病毒阳性样本，提高血液筛查质量，降低病毒性疾病输血传播风险，保证血液安全性。

　　关键词：血站；核酸扩增技术；酶联免疫法

　　引言

　　从医院实际发展来看，血液供给主要来自血站，需要保证血液、血液制品安全性，才能有效预防、控制输血相关传染病，为血液使用安全提供保障。目前血站在日常血液筛查中，主要会采取酶联免疫法进行检测，通过该种技术可以发现血液中是否存在梅毒螺旋体血清、艾滋病病毒抗原与抗体、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原等，便于血液筛查。但是在实际应用中不能在最大程度上保证筛查准确性与有效性。随着临床不断发展，核酸扩增技术被逐渐应用到血液检查中，有着较高灵敏度、特异度，在一定程度上能让多种病毒检测窗口期减少，这为血站血液筛查相关研究提供了新方向。文中对血站平行筛查血液中应用核酸扩增技术、酶联免疫法的价值进行了分析，具体如下。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　本次选取主要为血站中收集的无偿献血者标本15427例。各个无偿献血者标本均留取酶联免疫法样管、核酸扩增技术样管。各个标本均存放在2-8℃冰箱中，并于采样后4h内进行血液标本处理，操作步骤包括1500g室温离心（间隔20min）、低温离心，将离心后的样本存放于2~8℃冰箱中，在24h内完成核酸扩增技术检测。

　　1.2方法

　　各样本进行平行筛查血液操作，检测技术包括核酸扩增技术与酶联免疫法。

　　1.2.1仪器准备

　　①全自动加样设备；②全自动混样设备；③酶免分析设备；④核酸扩增检测设备；⑤罗氏诊断Cobas's 201血液核酸血筛平台设备；⑥核酸提取设备；⑦实时荧光定量PCR设备；⑧低温大容量离心设备。

　　1.2.2试剂准备

　　①HBsAg检测试剂：来自艾康生物技术（杭州）有限公司，国药准字S20000059；②抗-HCV检测试剂盒（来自上海飞龙医用诊断用品有限公司，国药准字S2020081）；③抗-HIV-1/2检测试剂盒（来自北京玛诺生物制药有限公司，国药准字S20040057）；④核酸扩增技术试剂（来自华美生物工程公司，国药准字S20030020）。各种试剂配套的耗材均由对应的试剂公司提供。此外，乙肝血清学进行实验试剂补充。

　　1.3判断标准

　　（1）酶联免疫法：若标本HBsAg/抗-HCV/抗-HIV-1/2存在2种试剂阳性反应情况，则可判断检测结果为阳性。若标本HBsAg/抗-HCV/抗-HIV-1/2存在2种试剂反应阴性情况，则可判断为阴性。若只有1种试剂出现阳性情况，那么应开展核酸扩增技术检测。

　　（2）核酸扩增技术阳性判断标准：混样表现为阳性，拆分也表现为阳性；核酸扩增技术阴性判断标准：混样表现为阳性，但是拆分表现为阴性。

　　（3）对于核酸检测结果呈阳性标本，需利用分项定量检测技术以及乙肝血清学，开展补充试验操作；当检测为阳性结果，需要继续进行分项定量检测（包括HBV DNA、HIV RNA、HCV RNA）工作、乙肝5项检测工作。

　　1.4统计学方法

　　分析目标为1.3中项目，所用工具为22.0最新版本的SPSS，分析各类数据期间，开展的方式与形式：计数类分别为χ2值、[n（%）]，计量类分别为t值、（x—±s），统计值P<0.05，则有一定意义或价值。

　　2结果

　　2.1酶联免疫法与核酸扩增技术检测结果

　　经酶联免疫法筛查后HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2无反应性及仅1种试剂为反应性的标本共15329例；经核酸扩增技术检测的15329例，发现阴性标本15231例，阳性标本为98例，阳性标本检出率达到0.64%。

　　2.2乙肝血清补充试验与分项定量检测结果

　　酶联免疫法检测后，开展HB-sAg、抗-HBs、抗-HBe、HB-eAg、抗-HBc等筛查工作，检测有52例属于阳性标本，确认阳性率达到53.06%；通过定量检测98例核酸扩增技术检测阳性标本，结果发现有43例为HBV DNA阳性，阳性率达到82.69%（43/52），结果未发现HIV RNA阳性样本、HCV RNA阳性样本。

　　3讨论

　　乙型病毒性肝炎（降低生活质量，影响日常活动，增加肝硬化与肝癌发病率）、丙型肝炎（随着病程发展易发展为肝硬化腹水、肝性脑病、肝衰竭等严重疾病）、艾滋病（导致人体产生严重免疫缺陷，易发生细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染等情况，治疗存在较大困难，易引起死亡）等均为常见传染疾病，主要通过血液进行传播，一旦血站为医院患者提供存在病毒的血液，则容易导致血液传播疾病，增加治疗难度。因此，需要重视血站血液筛查工作，及时发现血液中存在的病毒抗原，将其筛选出来，保证血液质量。

　　酶联免疫法为血站中血液筛查常用方式，该种检测方式，是将酶的特异性催化反应作为操作原理，将特异性抗体固定于微孔板上，封闭与抗原结合位点，并放置被检样品；让被检分子、抗体之间发生特异性结合，将未结合的分子去除，加入与抗体结合的酶标记二抗，允许其与样品充分反应，形成复合物；将未结合的酶标记物清洗掉后，将底物加入其中，让酶催化底物，产生色变反应，通过色素减少对被检分子浓度、底物反应酶标记分子浓度进行观察，借助光谱仪对读数进行测量，量化被检分子浓度。该种检测方式具有以下优势：①可以在数小时内完成检测，而且可以进行高通量检测，可以同时检测多个样品并且可以持续进行检测；②可以高度特异性地检测出目标抗体，而且可以检测出低浓度样品；③使用标准化的试剂盒进行检测，不需要特殊的设备和设施。利用酶联免疫法能够通过检测血液或者体液，发现艾滋病病毒抗原与抗体、乙肝两对半和乙肝DNA的数量，有利于乙肝与艾滋病血液样品的筛查。但是酶联免疫法在操作中，会受到多方面因素影响，导致检测结果出现错误，包括样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染；酶标板洗涤不彻底；抗体量过多导致非特异性结合；加样量不一致；样品数量不整齐等。

　　核酸扩增技术的应用，会将模板DNA、引物、4种脱氧单核苷酸等作为基础，利用有着耐高温特性的DNA聚合酶，形成酶促成反应；同时模板选择欲扩增的DNA，引物选择模板正常、负链末端互补2种寡核苷酸，复性结合过程借助模板DNA变性以及模板引物进行，经过DNA聚合酶作用，形成引物链延伸反应情况，来合成新的模板DNA；上阶段循环产生的DNA，通过变形后，变为下一阶段循环模板DNA。通过这种形式，模板DNA数量逐渐累积（累积形式为2n-2n），于2h范围内能够扩增到30n个循环DNA，数量可增加到原来数量无数倍。对于扩增后的产物，会借助凝胶电泳技术、Southern杂交技术或DNA序列分析技术等开展检测工作。检测原理为借助连接分子将DNA、抗体连接，让DNA借助抗体，于抗原之间进行特异性连接，生成抗原-抗体-DNA复合物；然后利用DNA片段作为指示系统，开展扩增操作，对抗原存在状态进行检验。该种检测方式具有灵敏度高（核酸扩增技术产物会按照指数方式成倍增加，可实现皮克量级待测模板扩增为微克量级，可在百万细胞中发现靶细胞。利用该种技术进行病毒检测，核酸扩增技术灵敏度较高，在细菌学中的应用可至少检出3个细菌）、特异性好（主要是由于引物、模板DNA之间可以特异、正确结合；会将碱基配对原则作为基础；TaqDNA聚合酶的合成反应具有忠实性；靶基因的特异度以及保守性较好）、能够区别强弱毒株、操作简便与快速（核酸扩增技术操作中会利用具有耐高温性质的TaqDNA聚合酶，反应液一次性放入，于DNA扩增液、水浴锅中开展变形-退火-延伸反应操作，可在2~4h之间结束扩增反应过程。分析扩增产物时会利用电泳分析法进行，并不强制要求使用同位素，不会导致放射性污染，便于推广应用）的优势，在传染病的诊断和流行病学普查方面有着较好效果[6]。在利用核酸扩增技术开展病原体检测工作时，可在短时间内完成，且检查结果准确性较高，不会导致污染，安全性较高；可用于制备探针和标记探针；能够精确区分不同病原体或同一病原体的不同型、不同株、不同分离物。另外，核酸扩增技术已经被应用到多种研究中，包括分子克隆研究、基因突变研究、核酸序列分析研究、肿瘤基因研究、抗癌基因研究、抗病毒药物研究等。但是核酸扩增技术在实际应用中存在一定缺陷，核酸扩增技术产物在反复、多次扩增后，复制量大大增加，已超出该项技术检测上限，极易受到微量污染影响，降低检测结果准确性；在进行试剂配制时，一旦操作容器、移液器、枪头、溶液等受到污染，就会造成试剂污染，降低检测准确性；部分样品中存在病毒，如果弥散到空气中易造成交叉污染[7]。邓群华[8]等研究中分别利用核酸检测、酶联免疫法对血站血液样本进行了检测，酶联免疫法发现存在乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷等病毒，但是存在一定漏检情况，对合格样本再次进行核酸检测，又发现存在上述病毒。这在一定程度上说明联合应用核酸检测、酶免检测可获得理想检测结果。

　　结合文中研究结果，酶联免疫法检测结果中发现有15329例属于HBsAg（乙型肝炎表面抗原）、抗-HCV（丙肝病毒抗体）、抗-HIV-1/2（艾滋病病毒1型/艾滋病病毒2型）无反应性、仅1种试剂反应性情况；通过核酸扩增技术检测发现15329例样本中有98例为阳性标本，阳性标本检出率达到0.64%。这与相关研究结果类似，均证实酶联免疫法与核酸扩增技术均有利于检出乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等病毒携带者。文中结果显示，酶联免疫法检测后，开展HB-sAg、抗-HBs、抗-HBe、HB-eAg、抗-HBc等筛查工作，明确阳性标本为52例，确认阳性率达到53.06%；通过定量检测98例核酸扩增技术检测阳性标本，结果发现有43例为HBV DNA阳性，阳性率达到82.69%（43/52），结果未发现HIV RNA阳性样本、HCV RNA阳性样本。宋晓波发现对无偿献血者血液进行病原体酶联免疫吸附试验、核酸检测，可发现乙肝病毒携带者、丙肝病毒携带者、人类免疫缺陷病毒携带者，不同检测方式有着各自优势，联合应用可提高检测结果准确率。郑东宁文中分析了血液病毒检测中应用核酸检验、酶联免疫检测等方法对检测结果准确度影响，发现联合应用核酸检验、酶联免疫检测，有着较高的乙型肝炎病毒阳性预测值、丙型肝炎病毒阳性预测值、人类免疫缺陷病毒阳性预测值，这与文中研究内容类似，证实利用酶联免疫法、核酸扩增技术开展血液病毒分析工作，有利于及时、准确发现病毒，避免漏检。

　　综上所述，在血站血液筛查中联合应用核酸扩增技术检测、酶联免疫法检测平行筛查，可达到两种检测手段互补的效果，及时发现病毒阳性样本，提高血液筛查质量，降低病毒性疾病输血传播风险，保证血液安全性。

      参考文献

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