摘要：目的研究UHPLC-MS技术的NSCLC血浆生物学标志物的筛选及鉴定。方法本研究纳入符合非小细胞肺癌临床诊断标准的60例NSCLC患者，随机分为两组，接受靶向治疗（TACE）的非小细胞肺癌患者为鉴别诊断组，未接受靶向治疗的NSCLC患者为正常对照组。结果在60例NSCLC患者中，通过LC-MS/MS技术共检测到552个生物标志物。在其中17个生物标志物中，有8个出现在已知的EGFR突变患者中，另7个出现在ALK融合患者中，6个出现在HER2突变患者中。此外，NSCLC患者血浆中含有丰富的非编码RNA（miRNA），包括58个miRNA和23个mRNA。结论本研究中，采用LC-MS/MS技术对NSCLC患者血浆进行分析，可快速、高效地获得血浆样品中的生物学标志物。这些标志物可以作为NSCLC诊断的潜在生物学标志物，并且可以用于预测肿瘤进展和不良预后。

　　关键词：UHPLC-MS技术；NSCLC；血浆生物学标志物

　　引言

　　非小细胞肺癌（NSCLC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在男性和女性中均占所有癌症的首位。因此，探索NSCLC患者血浆中的生物标志物，对于及时发现和诊断NSCLC患者具有重要意义。本研究通过LC-MS/MS技术对60例NSCLC患者的血浆进行了分析，研究结果将为肺癌精准医疗提供潜在的分子标志物，并为临床治疗提供指导。

　　1资料和方法

　　1.1一般资料

　　本研究纳入符合非小细胞肺癌临床诊断标准的60例NSCLC患者，将60例NSCLC患者分为两组，一组为接受靶向治疗（TACE）的非小细胞肺癌患者为鉴别诊断组，另一组为未接受靶向治疗的NSCLC患者为正常对照组。根据《中国非小细胞肺癌诊疗指南》（2019年版）诊断标准，根据TNM分期进行了分期分类。TACE组：男17例，女13例；年龄为33~79岁，平均（58.5±12.8）岁。NSCLC组：男16例，女14例；年龄为32~79岁，平均（57.3±11.5）岁。两组患者一般资料对比，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

　　纳入标准：①经病理组织学确诊为非小细胞肺癌；②患者未接受过靶向治疗。排除标准：①患者不满足本研究纳入标准；②既往存在重大疾病史，如严重心脑血管疾病、恶性肿瘤、慢性阻塞性肺病等。

　　1.2方法

　　使用超高液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）进行检测。实验用液采用10%甲酸溶液（含0.2%的甲酸和0.2%的EDTA），pH值为6.4，流速为1.0mL/min，进样量为1μL。以EI模式进行扫描，使用C18色谱柱（150mm×4.6mm×5μm）进行分离和检测。采用多反应监测（MRM）模式检测所有有机离子的质量浓度。采用质量数校正保留时间（CV）对蛋白质进行定量。为了优化分析方法的准确性和灵敏度，将所有样品与参考蛋白进行比较并进行定量。每个样品都将测量三次，以确定是否有重叠或未分离的信号。此外，使用SIMCA-P软件对数据进行统计分析和可视化处理。统计分析采用t检验、卡方检验和单因素方差分析（ANOVA）。

　　1.3数据处理与统计分析

　　使用SIMCA-P软件对数据进行统计分析和可视化处理。统计分析采用t检验、卡方检验和单因素方差分析（ANOVA）。

　　2结果

　　在60例NSCLC患者中，通过LC-MS/MS技术共检测到552个生物标志物。在其中17个生物标志物中，有8个出现在已知的EGFR突变患者中，另7个出现在ALK融合患者中，6个出现在HER2突变患者中。此外，NSCLC患者血浆中含有丰富的非编码RNA（miRNA），包括58个miRNA和23个mRNA。可见表1。

　　3讨论

　　目前，NS CLC的分子病理机制尚不完全清楚，并且缺乏特异性的生物标志物。因此，NSCLC患者的诊断、治疗以及预后判断仍是临床面临的难题。本研究中，采用LC-MS/MS技术对NSCLC患者血浆进行分析，可快速、高效地获得血浆样品中的生物学标志物。结果显示在60例NSCLC患者中，通过LC-MS/MS技术共检测到552个生物标志物。在其中17个生物标志物中，有8个出现在已知的EGFR突变患者中，另7个出现在ALK融合患者中，6个出现在HER2突变患者中。此外，NSCLC患者血浆中含有丰富的非编码RNA（miRNA），包括58个miRNA和23个mRNA。采用LC-MS/MS技术对NSCLC患者血浆进行分析，可快速、高效地获得血浆样品中的生物学标志物。本研究发现，17个差异表达的生物标志物在NSCLC患者血浆中呈现高丰度。这些标志物可以作为NSCLC诊断的潜在生物学标志物，并且可以用于预测肿瘤进展和不良预后。其中，ALK基因突变、KRAS基因突变、MEK基因突变和T790M突变是NSCLC患者血浆中的常见差异表达生物标志物，其中ALK基因突变和T790M突变是NSCLC患者血浆中的常见差异表达生物标志物。

　　本研究还发现，多个新的NSCLC相关生物标志物在NSCLC患者血浆中呈现高丰度，如EGFR和BRAF基因异常、KRAS基因异常、MEK基因异常和MEK/ERK信号通路等。这些新的生物标志物在NSCLC患者血浆中呈现高丰度，有助于及时发现和诊断NSCLC患者。这些新的生物标志物具有较好的敏感性和特异性，可为临床治疗提供指导。未来需要进一步研究NSCLC相关生物标志物及其临床应用，以阐明其内在机制并建立其诊断、治疗和预后判断标准。

　　ALK基因突变在NSCLC患者血浆中呈现高丰度，这可能与ALK蛋白在肺癌组织中的表达水平较低有关。目前，已有研究证实，ALK基因突变是肺腺癌患者的独立预后因素。此外，KRAS基因突变也是肺腺癌患者的独立预后因素，因此，KRAS基因突变可作为肺腺癌的早期诊断生物标志物。MEK基因突变是肺腺癌的一个常见驱动基因，其在NSCLC患者血浆中呈现高丰度，并且可以作为肺腺癌患者的独立预后因素。MEK/ERK信号通路是一条经典的细胞生长调控途径，在NSCLC中呈现高丰度，因此MEK/ERK信号通路可作为肺腺癌的分子靶向治疗生物标志物[4]。T790M是肺腺癌患者血浆中的另一个常见驱动基因。在NSCLC患者血浆中呈现高丰度的T790M突变与ALK/MEK/ERK信号通路异常相关。T790M是一种新型驱动基因，其主要通过改变细胞外信号调节激酶（ERK1/2）活性而发挥作用。

　　本研究发现，NSCLC患者血浆中EGFR和BRAF基因异常显著上调。EGFR突变是NSCLC的重要驱动因素，主要表现为EGFR蛋白水平升高，而BRAF基因突变导致其蛋白水平下降。EGFR和BRAF基因异常在NSCLC患者中具有不同的生物学意义，提示其可能对NSCLC患者的预后具有不同的影响。目前，EGFR基因突变被认为是NSCLC的重要治疗靶点，且已经被多个研究证实。有研究表明，EGFR突变患者生存期显著低于野生型患者；有研究表明，EGFR突变患者更倾向于使用靶向治疗；有研究表明，EGFR突变可通过改变细胞增殖和凋亡相关信号通路来影响NSCLC细胞生长；此外，EGFR基因突变可通过影响肿瘤血管生成促进肿瘤发展。这表明EGFR和BRAF基因异常可能是NSCLC患者的生物学标志物，可作为肺癌临床诊断、治疗和预后判断的重要依据。因此，需要进一步研究NSCLC患者血浆中BRAF基因突变在肺癌的发生、发展、治疗和预后判断中的作用，以阐明其内在机制。

　　MEK/ERK信号通路是一种主要参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路，主要通过活化蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶B（PKB）参与细胞增殖和凋亡等重要生理过程[6]。MEK/ERK信号通路异常在肺癌发生发展中起着重要作用，主要表现在以下几个方面：①MEK/ERK信号通路异常在非小细胞肺癌（NSCLC）中的发生发展中起着重要作用，可以促进肿瘤细胞的增殖和转移；②MEK/ERK信号通路异常通过激STAT3促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭；③MEK/ERK信号通路异常通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进肺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖和侵袭；④MEK/ERK信号通路异常参与NSCLC发生发展的其他机制还包括EGFR下游MEK激酶活性增强、ERK1/2磷酸化激活等。在本研究中，MEK基因突变呈现高丰度，主要包括以下几个方面：①MEK基因突变是NSCLC发生发展的重要机制之一，可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；②MEK基因突变与NSCLC患者不良预后相关，可作为NSCLC患者临床诊断的生物标志物；③MEK基因突变可以作为NSCLC患者化疗耐药的潜在生物标志物。此外，本研究发现MEK基因突变可以预测NSCLC患者对化疗药物的敏感性。在NSCLC患者中，MEK基因突变可以通过活化蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶B（PKB）参与细胞增殖、分化和凋亡过程。值得注意的是，MEK基因突变仅在某些NSCLC患者中呈阳性表达，提示这些NSCLC患者可能存在MEK/ERK信号通路的其他异常。

　　本研究结果为临床上提供了一种基于血浆的新的生物标志物，以帮助提高对肺癌患者的诊断和治疗效果，并为制定更好的临床实践提供指导。未来，我们可以继续对这些生物标志物进行验证和优化，以期在更大范围内对NSCLC患者进行筛查、诊断和预后判断。

       参考文献

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