[摘要]目的探讨真核起始因子（Eukaryotic Initiation Factor,EIF）4E在卵巢癌中的作用以及对血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）A和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）表达的影响。方法使用SKOV3卵巢癌细胞，分析在线数据以比较卵巢癌患者和正常样本中EIF4E、VEGFA和CCND1的表达差异。进行EIF4E抑制剂4EGI-1的三维细胞培养实验，并通过逆转录定量聚合酶链式（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）技术和Western Blot比较mRNA和蛋白水平。结果癌症基因组图谱（Can‐cer Genome Atlas,TCGA）显示，卵巢癌患者中VEGFA和CCND1的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。EIF4E与VEGFA和CCND1呈正相关（P均＜0.05）。在4EGI-1处理的SKOV3细胞中，EIF4E、VEGFA和CCND1表达均显著降低，差异有统计学意义（t=9.819、3.508、3.289，P均＜0.05）；此外，4EGI-1处理组的p-EIF4E蛋白表达水平为（0.33±0.14）%，显著低于对照组（1.02±0.07）%，差异有统计学意义（t=8.818，P=0.0001），同时4EGI-1处理组的VEGFA和CCND1蛋白水平也显著降低（t=5.064、6.334，P均＜0.05）。结论EIF4E在卵巢癌肿瘤中高表达。EIF4E抑制剂4EGI-1可能通过调节VEGFA和CCND1的表达发挥作用，因此EIF4E可能成为卵巢癌治疗的潜在靶点。

　　[关键词]卵巢癌；真核起始因子4E；血管内皮生长因子A；细胞周期蛋白D1

　　Inhibition of EIF4E Down-regulates the Expression of VEGFA and CCND1 to Inhibit the Progression of Ovarian Cancer

　　YAO Qiuhui,LIU Ya,WANG Jing

　　Department of Obstetrics and Gynecology,the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Southwest Medi‐cal University,Luzhou,Sichuan Province,646000 China

　　[Abstract]Objective To investigate the role of eukaryotic initiation factor(EIF)4E in ovarian cancer and its effect on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)A and cyclin D1(CCND1).Methods SKOV3 ovarian can‐cer cells were used to analyze the online data to compare the expression differences of EIF4E,VEGFA and CCND1 in ovarian cancer patients and normal sample.The three-dimensional cell culture experiment of EIF4E inhibitor 4EGI-1 was carried out,and the mRNA and protein levels were compared by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western Blot.Results Cancer genome atlas(TCGA)data showed that the expression levels of VEGFA and CCND1 were significantly increased in ovarian cancer patients,and the differences were statistically significant(both P＜0.05).EIF4E was positively correlated with VEGFA and CCND1(both P＜0.05).In SKOV3 cells treated with 4EGI-1,the expression of EIF4E,VEGFA and CCND1 were significantly decreased,and the differences were statisti‐cally significant(t=9.819,3.508,3.289,all P＜0.05).In addition,the expression level of p-EIF4E protein in the 4EGI-1 treatment group was(0.33±0.14)%,which was significantly lower than that in the control group(1.02±0.07)%,and the difference was statistically significant(t=8.818,P=0.0001).At the same time,the levels of VEGFA and CCND1 protein in the 4EGI-1 treatment group were also significantly decreased(t=5.064,6.334,P＜0.05).Conclusion EIF4E is highly expressed in ovarian cancer.The EIF4E inhibitor 4EGI-1 May play a role by regulating the expression of VEGFA and CCND1,so EIF4E may be a potential target for ovarian cancer treatment.

　　[Key words]Ovarian cancer;Eukary initiation factor4E;Vascular endothelial growth factorA;CyclinD1

　　卵巢癌是女性常见的一种恶性肿瘤,死亡率在妇科癌症中较高[1-2]。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）A通过多种机制促进新血管形成，是恶性肿瘤治疗的重要策略[3]。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）在卵巢癌等多种癌症中存在扩增，扩增的CCND1可导致异常细胞周期，促使肿瘤发生[4-5]。真核翻译起始因子（Eu‐karyotic Initiation Factor,EIF）4E与癌症不良预后相关，通过促进VEGF等基因的翻译和转录参与癌细胞增殖和存活[6]。有研究发现在卵巢癌组织中EIF4E呈高表达，并且可能通过增强CCND1的翻译促进细胞增殖[5]。因此，本研究旨在探究能否通过抑制EIF4E表达来影响VEGF和CCND1的表达，从而减缓卵巢癌的发生和发展。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1细胞培养

　　将SKOV3细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）培养于含有10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco′s Modified Eagle Me‐dium,DMEM）中，37℃、5%CO2条件下培养，2~3 d传代1次。

　　1.2三维立体培养

　　将SKOV3细胞制备成5×105/mL的单细胞悬液。将0.5 mL单细胞悬液加入康宁（Corning）24孔超低吸附微孔板中，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。分别加入0.5 mL培养液或0.5 mL EIF4E抑制剂4EGI-1（Selleck，40μM）。48 h后，倒置相差显微镜随机取5个视野拍照记录，实验重复3次。

　　1.3 GEPIA在线分析

　　利用GEPIA在线分析工具分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）肿瘤样本和GTEx正常样本中VEGFA、CCND1和EIF4E的表达情况。

　　1.4 RT-PCR检测

　　采用逆转录定量聚合酶链式（Reverse Transc-ription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）技术检测治疗组和对照组样本中EIF4E、VEGF和CCND1的mRNA表达水平。使用南京Vazyme公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录试剂盒制备cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix进行扩增，以GAPDH作为内参。PCR引物的序列见表1。

　　预变性设置为95℃,60 s；循环反应：95℃变性10 s，60℃退火30 s，共40个循环，测定熔解曲线。每个样本进行3次实验，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。

　　1.5 Western Blot

　　采用Western Blot技术检测治疗组与对照组组织中EIF4E、VEGF以及CCND1的蛋白表达情况。使用放射免疫沉淀法裂解缓冲液（Radio Immuno‐precipitation Assay Lysis buffer,RIPA）裂解细胞样本，BCA试剂盒（上海碧云天生物，P0012S）检测总蛋白浓度。电泳采用5%浓缩胶和10%分离胶。使用北京博奥森生物技术的phospho-EIF4E兔抗人（bs-2446R，1∶1 000）、武汉三鹰生物的EIF4E鼠抗人（66655-1-Ig，1∶5 000）、VEGFA鼠抗人（66828-1-Ig，1∶1 000）、CCND1鼠抗人（60186-1-Ig，1∶5 000）和上海碧云天生物的GAPDH鼠抗人（AF0006，1∶1 000）的一抗，辣根过氧化物酶偶联的二抗进行免疫反应。使用超敏ECL化学发光试剂（P0018S，上海碧云天生物）进行显影，ChemiDocTM成像系统（Bio-RadLaboratories）进行图像分析。

　　1.6统计方法

　　采用GraphPad软件，计量资料（蛋白表达水平）符合正态分布，以(±s）表示，行t检验。相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 SKOV3细胞的3D培养及4EGI-1抑制效果

　　4EGI-1给药组中，SKOV3细胞成球的直径为（98.33±30.61）μm，小于对照组的（55.35±18.71）μm，差异有统计学意义（t=2.959，P=0.0143）。见图1。

　　2.2卵巢癌TCGA样本和GTEx正常样本中基因表达及相关性

　　在卵巢癌组织中，VEGFA、CCND1和EIF4E的表达显著高于正常对照组，其中VEGFA和CCND1表达对比，差异有统计学意义（P均＜0.01），见图2A~C。相关性分析显示，VEGFA和CCND1与EIF4E呈正相关（P均＜0.05），见图2D、2E。

　　2.3 SKOV3细胞EIF4E抑制组和对照组的mRNA表达

　　4EGI-1处理后，EIF4E的表达[（0.58±0.09）%]显著降低，差异有统计学意义（t=9.819，P=0.0022），同时VEGFA和CCND1的mRNA表达分别为（0.76±0.15）%和（0.81±0.11）%，较处理前显著下降，差异有统计学意义（t=3.508、3.289，P=0.025、0.046）。见图3。

　　2.4 SKOV3细胞EIF4E抑制组和对照组的蛋白表达

　　4EGI-1治疗组p-EIF4E的表达（0.33±0.14）%低于对照组（1.02±0.07）%，差异有统计学意义（t=8.818，P=0.0001）；4EGI-1治疗组的VEGFA为（0.53±0.18）%，低于对照组的（1.03±0.07）%，差异有统计学意义（t=5.064，P=0.0023）；治疗组的CCND1为（0.44±0.16）%，低于对照组的（1.024±0.08）%，差异有统计学意义（t=6.334，P=0.0007）。见图4。

　　3讨论

　　卵巢癌是世界上病死率最高的致死性妇科恶性肿瘤之一，其分子病理机制具有多样性，但其细胞信号通路和分子机制尚不明了[7]。研究表明，EIF4E在蛋白质合成中发挥关键作用，并在多种癌症中扮演重要角色[8]。在卵巢癌的研究中，晚期卵巢癌组织中EIF4E的高表达与患者低生存率相关[7]。抑制EIF4E的功能能够抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭，有报道显示，敲除EIF4E的表达水平可以显著抑制癌细胞的迁移和侵袭能力，同时可提高顺铂等抗肿瘤药物对卵巢癌治疗的敏感性[9]。结合数据库分析结果卵巢癌患者EIF4E的表达高于正常样本，说明干预EIF4E的表达可能对卵巢癌患者治疗产生一定的作用。

　　VEGF在卵巢癌中起关键作用，促进血管生成和增加血管通透性[10]。卵巢癌肿瘤细胞释放过多VEGF，导致新生血管生成，利于肿瘤细胞获取营养和氧气，进而促进生长和转移[11]。VEGFA作为VEGF家族重要的成员之一被广泛研究，有研究显示卵巢癌肿瘤中VEGFA的表达水平较高[12]，这与公共数据分析结果一致。在乳腺癌患者中，EIF4E过表达与较高的VEGF水平相关[13]，通过4EGI-1处理卵巢癌细胞系后VEGFA的mRNA和蛋白表达水平下调，说明抑制EIF4E可能通过调节VEGF的表达影响卵巢癌细胞的血管生成能力。

　　CCND1在卵巢癌中过度表达与肿瘤增殖活性增加相关[14]。高水平的CCND1促进细胞周期进行，导致细胞无限增殖[5,15]。公共数据库分析结果验证了CCND1在卵巢癌组织中的高表达。本研究还发现通过4EGI-1处理后CCND1的mRNA和蛋白水平呈不同程度的下调，这与已知的报道卵巢癌组织中EIF4E与CCND1蛋白表达呈正相关一致[7]，进一步证实抑制EIF4E可能通过调节CCND1的表达影响卵巢癌细胞的增殖和细胞周期进程。

　　综上所述，EIF4E在卵巢癌中可能与患者的临床病理特征和预后密切相关。EIF4E介导限速过程，该过程驱动许多同源蛋白如CCND1和VEGF的选择性蛋白翻译，从而促进肿瘤生长、转移和治疗抗性[16]，本研究的相关性分析结果进一步证实了在卵巢癌中EIF4E、VEGFA和CCND1之间的正相关关系，抑制EIF4E同时也抑制了VEGFA和CCND1的表达，为卵巢癌患者提供了更有效的治疗选择。

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