[摘要]目的探究中药混合液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Sureus,MRSA）的体外抗菌作用。方法选取2022年1月—2023年6月江苏省启东市中医院检验科临床分离的40株MRSA。万古霉素、中药混合液对MRSA的体外最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）值采用微量肉汤稀释法测定；用K-B纸片扩散法测定万古霉素和中药混合液对MRSA的抑菌效果，探究不同药物浓度对MRSA抑菌活性的影响。结果万古霉素MIC值为（1.56±0.55）mg/L，低于中药混合液的（1.63±0.62）mg/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）。万古霉素抑菌圈直径为（20.56±0.87）mm，优于中药混合液的（19.89±0.73）mm，差异有统计学意义（P＜0.05）。抑菌圈直径大小随浓度增加而增大且中药混合液各浓度抑菌圈直径均大于万古霉素，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论中药混合液对MRSA的体外最低抑菌浓度极低，可以有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。

　　[关键词]中药混合液；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；体外抗菌；微量肉汤稀释法；最低抑菌浓度

　　Study on Antibacterial Effect of Chinese Medicine Mixture on Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus in Vitro

　　GU Juan

　　Department of Clinical Laboratory,Qidong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Qidong,Jiangsu Province,China 226200

　　[Abstract]Objective To explore the antibacterial effect of Chinese herbal mixture on methicillin-resistant Staphylo‐coccus aureus(MRSA)in vitro.Methods 40 strains of MRSA clinically isolated from the clinical Laboratory Depart‐ment of Qidong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province from January 2022 to June 2023 were se‐lected.The value of minimum inhibitory concentration(MIC)of vancomycin and Chinese medicine mixture on MRSA in vitro was determined by microbroth dilution method.K-B disk diffusion method was used to determine the antibacterial effect of vancomycin and Chinese medicine mixture on MRSA,and to explore the influence of different drug concentra‐tions on the antibacterial activity of MRSA.Results The MIC value of vancomycin was(1.56±0.55)mg/L,lower than that of traditional Chinese medicine mixture(1.63±0.62)mg/mL,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The diameter of the inhibition zone of vancomycin was(20.56±0.87)mm,better than that of the traditional Chi‐nese medicine mixture(19.89±0.73)mm,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The diameter of the inhibition zone increased with the increase of the concentration,and the diameter of the inhibition zone of each con‐centration of the traditional Chinese medicine mixture was greater than that of vancomycin,and the differences were statistically significant(all P＜0.05).Conclusion The minimum inhibitory concentration of Chinese medicine mixture on MRSA in vitro is very low,which can effectively inhibit the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.

　　[Key words]Chinese medicine mixture;Methicillin-resistant Staphylococcus aureus;In vitro antibacterial;Microbroth dilution method;Minimum inhibitory concentration

　　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus,MRSA）是一种高度耐药的细菌，对全球医疗构成了严峻挑战。MRSA感染常导致严重的医院和社区感染，增加治疗难度和成本，甚至可能致死。目前，传统抗生素在治疗MRSA方面遇到重大难题，尤其是其对常规抗生素的高度耐药性[1-2]。万古霉素是常见的治疗方法之一，但近年来某些MRSA菌株对其也产生了耐药性，降低了疗效。此外，万古霉素需静脉注射，且可能对肾脏有不良影响，这进一步增加了治疗复杂性[3-4]。因此，本研究旨在探究中药混合液对MRSA的体外抗菌作用及其分子机制。研究选取2022年1月—2023年6月江苏省启东市中医院检验科临床分离的40株MRSA进行深入分析。通过研究中药混合液的抗菌活性，本研究期望为开发治疗MRSA感染的新策略提供重要信息。同时，这也可能帮助克服万古霉素等传统治疗方法的限制，并促进中药在现代医学中的应用。现报道如下。

　　1资料与方法

　　1.1菌株

　　选取于本院检验科临床分离的40株MRSA，均为无重复菌株；从卫生部临床检验中心购买质控菌株金黄色葡萄球菌（ATCC25923、ATCC29213）。

　　1.2仪器与试剂

　　万古霉素（英国OXOID）；M-H肉汤（批号：1009158，赛默飞世尔生物）；96孔微量稀释板（台州黄岩五州医用塑料厂）；中药混合液（自制）：黄连、黄柏、金银花、大黄、黄芩、马齿苋、鱼腥草、苦参各100 g，放在干燥箱中于800℃干燥2 h，用粉碎机粉碎，过筛（100目）后倒于1 000 mL烧杯中，加适量蒸馏水约1 000 mL（水面高于药材），置4°C冰箱中浸泡24 h之后取出，将药物放在电磁炉上，升温至沸点，然后用小火继续煮沸30 min。待冷却后，使用无菌纱布过滤，留下药液。将剩下的药渣与1 000 mL蒸馏水再次煮沸，小火煮沸30 min，然后冷却后，再次用无菌纱布过滤，留下药液。将这两次的药液合并后，以2 000 r/min的速度离心10 min，以去除杂质。然后将上清液通过无菌过滤，加热浓缩至只剩下80 mL液体（药液浓度为10 g/mL）。将这80 mL药液倒入无菌烧瓶中，进行高压灭菌处理，然后在4℃保存备用。

　　1.3方法

　　1.3.1 MRSA的检出MRSA菌株用K-B琼脂纸片扩散法（头孢西丁纸片）确认。首先，取40株不同来源的分离菌株，将它们接种到哥伦比亚血琼脂培养基上，在37℃下恒温培养24 h。观察菌落外观后，选择一个独立的菌落，将其溶解在0.9%的氯化钠溶液中，使之达到0.5 McFarland单位的浓度。随后在M-H培养板上均匀地涂上该菌液，并放上头孢西丁试纸。在37℃环境中继续培养24 h，然后检查是否形成了抑菌环。如果抑菌圈的直径≤21 mm，就判定为MRSA。对于被判定为MRSA的实验菌株，将它们再次接种到哥伦比亚血琼脂培养基上，在37℃下恒温培养24 h。观察菌落的形态，再次确认它们为MRSA菌株后，备用。

　　1.3.2药液配制用无菌的蒸馏水将万古霉素调制为1 280µg/mL浓度，分装后冷冻存放以备后用。

　　1.3.3菌悬液配制4~5个菌落从已分纯并过夜新鲜培养的细菌平板上挑取，用M-H肉汤培养6 h，菌液用1.8 mL M-H肉汤校正浊度至0.5 MacFarland，再与M-H肉汤混合稀释菌悬液至1.0×106 CFU/mL。

　　1.3.4 MIC测定用M-H肉汤倍比稀释备用的万古霉素和中药混合药物母液，使母液的浓度递减，依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.500、0.250、0.125、0.0 625µg/mL。随后，将96孔微量稀释板的每个孔中分别加入以下内容：试验菌液100µL/孔，不同稀释度的无菌M-H肉汤培养基和中药混合药液均100µL/孔。此外设立阳性对照组，添加万古霉素和无菌M-H肉汤培养基100µL/孔，以及空白对照组，添加生理盐水和无菌M-H肉汤培养基100µL/孔。接种后震动稀释板使其充分混匀，之后板被置于湿盒中，在35℃下培养18~24 h。试验菌的MIC值将被确定为能够使菌株保持无菌生长的最高药物稀释度。

　　1.3.5 K-B纸片扩散法万古霉素及中药混合液配置成100µg/mL母液，每个纸片直径6 mm，定量载样20µL，将直径为6 mm的圆形无菌空白纸片放入制备好的药物母液中浸泡40 min，在超净工作台中烘干，制成中药混合试验纸片，并无菌保存备用。取0.5麦氏单位的菌液，按标准的K-B法将菌液涂布于M-H平板上，室温放置15 min，待表面干后，用无菌镊子分别夹取生理盐水处理过的无菌纸片（购自杭州天和公司）、万古霉素纸片及中药混合试验纸片，分别贴在培养基的同一表面，每个贴片之间留有一定的间隔。万古霉素纸片作为阳性对照，生理盐水处理过的无菌纸片作为阴性对照。再把M-H培养基放入37℃恒温培养箱中培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从3个不同角度测量3次，计算其平均值。

　　1.3.6药物浓度对MRSA抑菌活性的影响万古霉素和中药提取液均用超纯水稀释，通过实验初步获得提取物较低抑菌浓度进行最低抑菌浓度（Mini‐mum Inhibitory Concentration,MIC）实验。按照1.3.4方法配制为0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0µg/mL，以溶剂为阴性对照，实验重复3次

　　1.4统计方法

　　使用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料（MIC值、抑菌圈直径）使用(±s）进行描述，组间比较用独立样本t检验，组内比较用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1万古霉素和中药混合液MIC比较

　　万古霉素MIC值为（1.56±0.55）mg/L，低于中药混合液MIC值（1.63±0.62）mg/mL，差异有统计学意义（t=17.92，P＜0.001）。

　　2.2万古霉素和中药混合液对MRSA抑菌效果比较

　　万古霉素抑菌圈直径为（20.56±0.87）mm，高于中药混合液抑菌圈直径（19.89±0.73）mm，差异有统计学意义（t=3.731，P＜0.001）。

　　2.3不同浓度万古霉素及中药混合液对MRSA抑菌效果比较

　　万古霉素与中药混合液抑菌圈直径大小均随浓度增加而增大，差异有统计学意义（P＜0.05），不同浓度中药混合液抑菌圈直径均大于万古霉素，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

　　3讨论

　　金黄色葡萄球菌是一种革兰阳性细菌，近年来因滥用抗生素导致耐药性菌株的增加，其中MRSA尤为常见。目前MRSA已在全球传播，由于其对多种常见抗生素耐药，严重威胁患者生活质量[5]。中药作为我国传统疾病治疗的重要方式，具有较强的抗菌能力和较低的耐药性，已成为研究新型抗MRSA药物的重要方向，有望解决耐药菌株感染难治问题，同时能够减少抗生素的使用。许多研究均认为中药在提高机体免疫力、逆转细菌耐药性等多方面具有潜力，有望为解决MRSA等耐药细菌感染问题提供了新的有力方法[6]。

　　本研究结果显示，MRSA对于万古霉素有很强的敏感性MIC值为（1.56±0.55）mg/L，这与刘学佳[7]的研究结果类似（MIC：1~2 mg/L），抑菌圈直径为（20.56±0.87）mm。而中药混合液MIC值为（1.63±0.62）mg/mL，显著低于万古霉素（P＜0.05），抑菌圈直径为（19.89±0.73）mm，抑菌圈直径大小均随浓度增加而增大，显示其具有一定的抗菌作用。本研究的中药混合液由八种具有清热解毒作用的中药组成，包括黄连、黄柏、金银花、大黄、黄芩、马齿苋、鱼腥草和苦参，主要针对MRSA的抗菌治疗。黄连是一种古老的中草药，含有生物碱，尤其对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。研究显示，黄连素等有效成分对MRSA表现出抗菌活性。黄柏的主要活性物质也是生物碱，如小檗碱，对多种致病细菌包括MRSA有抑制作用[8-9]。黄芩具有出色的抗菌能力，特别是在对抗MRSA方面效果显著[10]。大黄的根茎含有蒽系化合物等，表现出对MRSA的强烈抗菌活性[11]。金银花含有多种化学成分，如绿原酸，对多种致病菌有抑制作用[12-13]。马齿苋和鱼腥草同样具有清热解毒特性，其水煎剂对包括MRSA在内的多种细菌有抑制作用。苦参的水煎液也对多种细菌具有抑制作用。这些中药不仅可以单独使用，还可以组合使用，以增强对MRSA等细菌的抗菌效果。特别是黄连、黄柏、黄芩和金银花还具有破坏细菌生物膜的能力，进一步增强了其抗菌效果[14-15]。综合这些中药的特性，它们在组合应用时可望发挥更强的抗菌效果，对MRSA的治疗提供了新的可能性。

　　综上所述，中药混合液对MRSA具有一定的抗菌功效，其抑菌效果优于万古霉素。不过本研究样本量较少且相对单一，后续仍需要更多实验性研究以证实中药混合液对MRSA的抑菌作用。

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