[摘要]布鲁氏菌病在临床的表现缺乏一致性，存在明确的差异性、单一性。尽早通过实验室检测手段确诊疾病，对疾病后续治疗与康复有着积极的影响。以往开展布鲁氏菌病诊断，主要是应用血清学检测手段，但这类方法往往缺乏特异性，导致其应用受限。与之不同的是，核酸扩增检测技术被证明在诊断布鲁氏菌病中具有更高的灵敏度和特异性。本文对布鲁氏菌病发病机制、基因组学、核酸检测靶基因、核酸提取办法、核酸扩增试验等进行讨论，以期为布鲁氏菌病核酸检测技术提供参考。

　　[关键词]布鲁氏菌病；核酸检测；技术

　　Progress of Research Related to Nucleic Acid Detection Technology of Bru⁃cellosis

　　ZHONG Weixiang,GE Junli,LI Yanzhi,QI Zhenyong,SUN Wenhua

　　Shouguang People's Hospital,Weifang,Shandong Province,262700 China

　　[Abstract]Brucellosis lacks consistency in clinical manifestations,and there are clear differences and singularities.Confirming the diagnosis of the disease as early as possible by means of laboratory tests has a positive impact on the subsequent treatment and rehabilitation of the disease.In the past,the diagnosis of brucellosis was carried out mainly by applying serologic testing methods,but such methods often lacked specificity,leading to their limited application.In contrast,nucleic acid amplification assays have been shown to have higher sensitivity and specificity in the diagno‐sis of brucellosis.In this paper,the pathogenesis of brucellosis,genomics,target genes for nucleic acid detection,nucleic acid extraction methods,and nucleic acid amplification assays are discussed with a view to providing a refer‐ence for nucleic acid detection techniques for brucellosis.

　　[Key words]Brucellosis;Nucleic acid detection;Technology

　　布鲁氏菌病是指通过相应的形式接触受感染动物或者食用受污染食品，从而出现传播至人类的一种疾病。相关统计显示，在世界范围内，每年新发布鲁氏菌病病例高达50万左右[1]。现阶段，此病已经成为较为常见的细菌性人畜共患疾病之一。布鲁氏菌病的危害严重，可损伤诸多系统、器官，因此，尽早对疾病进行准确诊断非常有必要。当前诊断布鲁氏菌病时应用较多的方案是血清学检查策略，但因其缺乏特异性而被限制应用。核酸扩增试验不仅具有较高的灵敏度、特异性，而且应用安全性更高，所需要检测的用时更短，存在优异重复性[2]。本文主要从布鲁氏菌病的发病机制、基因组学、核酸检测靶基因、核酸提取方法、核酸扩增试验等开展讨论，评价布鲁氏菌病核酸检测技术进展。

　　1布鲁氏菌病发病机制

　　虽然当前临床对布鲁氏菌病的发病机制尚未完全明确，但是能够肯定的是，炎症细胞因子病理作用参与疾病发生与发展。布鲁氏菌感染机体后，能够在小胶质细胞、星形胶质细胞中复制。与此同时，小胶质细胞会优先被感染。布鲁氏菌及其外膜脂蛋白能够激活中枢神经系统，使之出现先天免疫表现。而借助于感染神经胶质细胞的形式，能够诱导炎症细胞因子释放[3]。常见炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、趋化因子。在上述因子作用下，将促进并加重炎症反应的发生。这种状态的持续进展，会造成小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生。同时，中性粒细胞浸润程度加剧，若情况严重，则宿主的星形胶质细胞会不断凋亡，致使神经元受损程度加剧。值得注意的是，星形胶质细胞凋亡程度如何，与肿瘤坏死因子信号传导息息相关。因此，炎症反应是布鲁氏菌病发生和发展中的关键机制。

　　2布鲁氏菌属的基因组学

　　布鲁氏菌的基因组序列、不同种属对人类的易感程度等，属于研究人类布鲁氏菌病核酸检测技术的基础。现有研究结果已发现布鲁氏菌属的11个种[4]。其中经典种6个，从海洋哺乳动物分离获得菌种为2个，新种3个。截至2018年底，观察到不同成员的基因组，将其与不同物种测序进行比照，明确菌株基因组的表现，发现布鲁氏菌染色体在体积方面，与核苷酸构成有一定的相似性。

　　排除猪种布鲁氏菌生物变种期间的特殊情况，其余种类布鲁氏菌的环形染色体，如2.1 Mb、1.2 Mb等，均为2条。与此同时，上述染色体编码区域的比例是相对恒定的。就构成基因而言，它们的分布是均匀的[5]。以更大的基因组为目标，布鲁氏菌的基因库相对较大，从而使其在不同的生态系统中生存。其发挥感染性特征，致使多种动物宿主被侵犯。布鲁氏菌能够感染人类的菌属主要为3个：分别是B.melitensis、B.abortus和B.sui。基因组的组成特征，为进一步选择目标基因检测布鲁氏菌病核酸提供指导。

　　3布鲁氏菌病核酸检测靶基因

　　当使用核酸检测技术诊断布鲁氏菌病时，选取的主要靶基因为omp2、omp31，均为编码外膜蛋白。对于部分B.abortus，有omp3l。但有一些缺失的存在，影响其作为扩增靶点的遗传基础。omp28（bp26）的灵敏度略低于bcsp31。16s RNA存在于细菌基因组的多个副本中，同时存在于不同的属和种特异性区域。因此其可以作为细菌感染分子诊断靶点的依据。其能够同其余已经出现形状改变的α-变形菌门等有一定的交叉反应。受此影响，诊断布鲁氏菌病期间，难以将其作为依据。而IS711插入序列等在布鲁氏菌病分子诊断中的优势显而易见，主要体现在较高的核酸检测灵敏度方面。

　　4核酸提取方法

　　病菌DNA数量多寡、纯度是否优异、完整程度是否良好，与核酸提取办法息息相关。而上述指标也会影响核酸扩增试验灵敏程度。与此同时，使用的核酸提取方法差异，可见从分化中获取DNA数量情况，存在2个或更多的量级[6]。因此，如果临床样本的目标DNA存量不足，则核酸提取方法的选择和应用在疾病诊断中即为关键环节。而核酸扩增试验的开展，使得试剂向着标准化方向发展，并且能够提高其准确程度。就当前来看，已经存在的布鲁氏菌病核酸检测技术试剂盒适合用于DNA提取。但需要注意的是，应用的试剂盒也因测试样品类型的不同而不同。例如，UltraClean试剂盒的污染最小，MasterPure试剂盒的敏感程度最高等。在已知布鲁氏菌Rev1细胞浓度相关的血清样本内，用于DNA提取的商业核酸提取试剂盒种类较多，并且操作均较为简单。而从DNA回收率、方法可重复程度、污染情况方面进行评价，可见有较大的差异性。就UltraClean试剂盒而言，可提取的布鲁氏菌DNA超过102 fg，并且应用蛋白水解酶提取形式效果显著，无污染。

　　另外，对于有细菌悬浮液的情况，应用Master‐Pure试剂盒的敏感程度最高。现阶段，对于大部分试剂盒而言，选择的是预先溶解，后纯化方式。即预先研磨血细胞，使其被溶解，并多次使用的酚进行处理，利于实现纯化目标。值得注意的是，研磨期间，红细胞容易被干扰，从而出现一定程度的损伤。同时，真核基因组血红蛋白、纯化工程系，应用酚相关溶剂的情况下，还会干扰后续聚合酶链反应检测。因上述手段无法明确布鲁氏菌是否存在于血清中亦或是血细胞内，所以难以有效实现布鲁氏菌病的精准判断，这也导致其在指导疾病治疗方面存在一定的局限性[7]。而布鲁氏菌血清血细胞同步核酸提取办法则能够分开获取血清、血细胞，可确保血细胞第一次纯化，后裂解。这种形式的操作进一步纯化致病菌的DNA，并有助于确定布鲁氏菌的存在。根据布鲁氏菌仅在血清中存在、仅在血细胞中存在、同时包含在血清血细胞中等的结果，可以明确布鲁氏菌的临床诊断，从而指导后续治疗[8]。但是此种提取方法也有一定的局限性，即在提取血细胞时应用时间较长，并且冲洗过程中发生损失一些单核细胞的可能性较大。

　　因此，就当前来看，实验室应用的商业试剂盒等，可促布鲁氏菌灭活。于样本内对布鲁氏菌的DNA进行提取，可进行诊断。然而人体中的布鲁氏菌病有着多样化的表现，所以明确局部感染因素非常关键。未来开展相关的测试，需要重视对受试者情况的分析，并明确样本的类型，来选择适宜的提取方案。

　　5核酸扩增试验

　　5.1普通聚合酶链反应

　　对于普通聚合酶链反应而言，主要是应用琼脂糖凝胶电泳来观察放大产物的表现。有关研究表明，在布鲁氏菌感染的检测方面，与传统的培养方法相比，普通聚合酶链反应的快捷性更为优异，并且具有较高的敏感程度，检验结果优于血清学方法[9]。但在特定的应用中，琼脂糖凝胶电泳需要使用染料。这种染料主要为溴化乙啶。此种着色剂控制放大产物着色后，应借助于紫外灯对条带情况进行观察。而该操作步骤会造成检测时间的增加。不仅如此，溴化乙锭对人体有害，具有致癌风险。因其一次检测样本量不多，所以对大样本筛查的效率不高，且在操作中需要进行开盖处理扩增产物，因此，造成泄漏的风险较高，甚至导致实验室污染。

　　5.2聚合酶链反应-酶免疫分析法

　　当前聚合酶链反应-酶免疫分析法应用广泛，并且能够规避普通聚合酶链反应的劣势。此种核酸扩增试验方法不使用溴化乙锭，可避免人体受到的损害。与此同时，借助于地高辛标记扩增产物，并对内部具有互补性质的生物进行扩增，可达到杂交目的。相关报道指出，聚合酶链反应-酶免疫分析法应用过程中，应用抗地高辛Fab-过氧化物酶偶联物进行探测，灵敏度可以达到10 fg，明显高于普通的聚合酶链反应，并且解释结果的客观性优异。更重要的是，此技术能够同时处理多个样本，不需要采用紫外光下以及在暗室操作[10]。

　　5.3复合聚合酶链反应技术

　　复合聚合酶链反应技术相较于普通聚合酶链反应、聚合酶链反应-酶免疫分析法而言，在灵敏度、特异性方面的优势更显著，且具有操作步骤简化、缩短检测用时、成本较低等特点[11]。现阶段，复合聚合酶链反应技术在动物疫病诊断、食品安全检测领域的应用较为广泛。虽然该技术可满足当前实际检测需求，但是具体应用期间，也有一定的局限性，即检测的靶标数目有限，并且容易造成污染。

　　5.4多重荧光定量聚合酶链反应技术

　　多重荧光定量聚合酶链反应技术的基础即为实时荧光定量聚合酶链反应技术，具有多靶标、定量检测的特征，这就使得其检测能力提升，并且存在更高的灵敏度及检测效率。相关研究指出，以TaqMan-MGB探针检测布鲁氏菌多重荧光定量聚合酶链反应技术，并让其在实际中应用，提示检测结果准确度提升，与聚合酶链反应相比，此项检测技术的灵敏度能够高出1 000倍[12]。但是需要注意的是，多重荧光定量聚合酶链反应技术应用期间，在其反应系统中，需要高强度的荧光背景。这一要求降低了低拷贝数样品的检测精度。通常情况下，基于染料法的多重荧光定量聚合酶链反应技术相较于探针法而言，成本方面优势更为显著。但是其检测结果被引物二聚体干扰的可能性较大，从而造成结果假阳性风险增加。

　　5.5数字聚合酶链反应

　　数字聚合酶链反应属于第3代聚合酶链反应技术，具有绝对定量的特点。在检测期间，分为两个步骤，分别为聚合酶链反应扩增和荧光信号分析。对于反应液体，它可以被稀释到单个分子的水平，再分成数万个单位，从而完成扩增反应。而在扩增完成后，获得荧光信号。如果有荧光信号，则标记为1。如果没有荧光信号，标记为0。数字聚合链在布鲁氏菌病检测中的应用中存在较高的灵敏程度[13]。而数字聚合酶链反应应用期间，缺陷也不容忽视，即检测数万个反应单元的用时长，不适宜应用在大量样本检测中。

　　5.6基于生物芯片的多病原核酸检测技术

　　基于生物芯片的多致病性核酸检测技术类别较多。常见有遗传芯片、微流体芯片等。应用基因芯片技术可允许荧光标记样品。同时，让寡核苷酸或探针的体外扩增杂交、反应。在扫描技术的基础上，对混合信号进行分析，得到样品的检测结果。此技术具有高通量特点，且微型化、易操作优势明显。虽然基因芯片应用的准确程度高，但其制作成本较高，并且有专利保护，所以应用受限。将其应用在布鲁氏菌病检测中，需制作布鲁氏菌可视化基因芯片，从而开展病原检测[14]。

　　微流体芯片的主要结构特点为微通道。同时，这种芯片技术的内部集成微型阀门、微型泵、微型反应器等。基于微流体网络，要求其允许自动处理样品，并使其产生一系列的反应，以完成许多步骤，如标记、检测等。根据微流控芯片的封闭式自动化检测优势，在实际应用期间，仅需要手动将样品加入，即可获取结果，并且检测结果准确度、检测效率、通量高。相关研究发现，在布鲁氏菌病检测期间，应用微流控芯片技术，可降低检测成本，并且与等温扩增方法相结合，能够进一步提高检测准确度、灵敏度[15]。后续研究中，还应注意纸质芯片的研发，以降低检测成本。

　　5.7基于高通量测序方法的多病原核酸检测技术

　　宏基因组高通量测序技术能够直接从样本内开展泛核酸检测。此技术的优势即放大样本内的全部核酸，并开展相应的测序[16]。与此同时，宏基因组高通量测序技术能够实现无差别的同时检测诸多病原微生物。与传统检测技术相比，该技术不仅检测通量更高，而且在灵敏度方面值得肯定，能够用于解释病原体的多样性、进化关系[17]。现阶段，宏基因组高通量测序技术在人感染性疾病的病原学诊断中应用较多。另外，此技术能够相对全息地获取样品内病原序列相关信息，这对于推动未来全病原检测具有重要意义。但在具体应用中，因价格的昂贵、检测时间长因素影响，使得其难以开展大样本测定。

　　6小结

　　综上所述，布鲁氏菌培养方法耗时耗力，且诊断阳性率不高。目前，借助于普通聚合酶链反应、聚合酶链反应-酶免疫分析法、多重荧光定量聚合酶链反应技术、数字聚合酶链反应、生物芯片的多病原核酸检测等核酸扩增检测技术，能够实现对病原菌的准确检测。基于各种核酸检测技术的优势，其适用情况也存在不同。本研究就布鲁氏菌病的基本情况和核酸检测不同技术进行了综述，以期为疾病的诊断提供参考。在后续疾病诊断和相关研究中，应注意选择操作更为简单、检验效率更低、经济性更为显著的核酸扩增检验方法。

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