【摘要】目的：观察精子DNA损伤与精液参数、胚胎发育及复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的相关性。方法：选择2019年1月—2022年3月佛山市高明区人民医院收治的300例有生育要求的精子DNA损伤患者设为观察组，再选择同期50例精子形态正常（精子正常形态比率≥4%）但配偶为RSA患者的男性设为流产组，50例有生育要求的健康男性设为对照组。比较三组精液参数（精子密度、精子活力、精子形态），根据精子DNA碎片指数将观察组患者分为高损伤组（精子DNA碎片指数≥30%，n=127）和低损伤组（精子DNA碎片指数＜30%，n=173），随访比较两亚组患者配偶（自然怀孕和应用辅助生殖技术成功怀孕后）胚胎发育情况及RSA发生情况，分析精子DNA损伤与精子密度、精子活力、精子形态、患者配偶胚胎发育、RSA发生的相关性。结果：三组精液参数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组精子密度、精子活力、精子形态均低于流产组、对照组，且流产组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。高损伤组治疗后自然成功怀孕配偶胚胎发育停滞率、RSA发生率高于低损伤组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高损伤组应用辅助生殖技术成功怀孕胚胎发育停滞率为6.97%，RSA发生率为11.63%。精子DNA碎片指数与精子密度、精子活力、精子形态呈负相关（P＜0.05），与患者配偶自然怀孕后胚胎发育停滞、RSA发生呈正相关（P＜0.05）。结论：精子DNA损伤与精液参数、胚胎发育及RSA具有一定相关性，精子DNA损伤程度越高，其精液质量越差，自然怀孕后胚胎发育停滞、RSA发生可能性越高，临床可根据患者精子DNA损伤情况，评估不育原因，为临床妊娠选择提供参考依据。

　　【关键词】精子DNA损伤；精液参数；胚胎发育；复发性流产

　　Correlation Analysis of Sperm DNA Damage with Semen Parameters,Embryonic Development and Recurrent Spontaneous Abortion/CAI Huanyuan,CHEN Yide,ZHANG Yu,WANG Jing,ZHANG Kaozhen,WEN Haipeng,YE Huixiang.//Chinese and Foreign Medical Research,2024,22(7):54-57

　　[Abstract]Objective:To observe the correlation between sperm DNA damage and semen parameters,embryonic development and recurrent spontaneous abortion(RSA).Method:A total of 300 patients with sperm DNA damage who had fertility requirements in Gaoming District People's Hospital in Foshan City from January 2019 to March 2022 were selected as the observation group,and 50 males with normal sperm morphology(sperm normal morphology ratio≥4%)whose spouses were RSA patients in the same period were selected as the abortion group,and 50 healthy males with fertility requirements were selected as the control group.The semen parameters(sperm density,sperm motility,and sperm morphology)among three groups were compared,according to the sperm DNA fragmentation index,the observation group patients were divided into the high damage group(sperm DNA fragmentation index≥30%,n=127)and the low damage group(sperm DNA fragmentation index＜30%,n=173),embryonic development and recurrence of RSA between the spouses of two subgroups of patients(successful pregnancy after natural pregnancy and using assisted reproductive technology)were followed up and compared,the relationship between sperm DNA damage and sperm density,sperm motility,sperm morphology,patients'spouse's embryonic development,RSA were analyzed.Result:There were significant differences in semen parameters among three groups(P＜0.05);the sperm density,sperm motility and sperm morphology of the observation group were significantly lower than those of the abortion group and the control group,which of the abortion group were significantly lower than those of the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05).The incidence of embryonic development arrest and RSA in the naturally successful pregnancy spouse in the high damage group after treatment were significantly higher than those in the low damage group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the success rate of embryo development arrest during pregnancy using assisted reproductive technology in the high damage group was 6.97%,and the incidence of RSA was 11.63%.The sperm DNA fragment index were negatively correlated with sperm density,sperm motility and sperm morphology(P＜0.05),and positively correlated with the stagnation of embryonic development and RSA after the natural pregnancy of the patients'spouse(P＜0.05).Conclusion:There are certain correlation between sperm DNA damage and semen parameters,embryonic development and RSA,the higher the degree of DNA damage to sperm,the poorer the quality of their semen,and the higher the likelihood of embryonic development stagnation and RSA occurrence after natural pregnancy,clinical evaluation of infertility can be based on the patients'sperm DNA damage,providing a reference basis for clinical pregnancy selection.

　　[Keywords]Sperm DNA damage Semen parameters Embryonic development Recurrent spontaneous abortion First-author's address:Gaoming District People's Hospital in Foshan City,Foshan 528500,China

　　精液质量是用于评估男性生育功能的重要参数，也是影响辅助生殖结局的主要因素之一[1]。在以往传统精液质量参数检测中，主要对精子浓度、体积、活力及形态学进行分析，但实际检测过程中，受检者在不同时间段进行精液分析所得出的各项参数差异性较大，DNA损伤的精子可使卵母细胞受精，但后期胚胎发育质量会受其影响，造成不良妊娠结果。因此，传统的精液质量参数检测已不能准确反映精子DNA完整性[2-3]。而精子DNA碎片指数作为一种新型指标，主要用于评估男性精液质量及其生育能力。临床研究表明，精子DNA损伤是一系列环境因素、污染物、全身及局部的疾病和医源性措施等多因素共同作用的结果[4-5]。为探究精子DNA损伤与精液质量参数的相关性及对胚胎发育、复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的影响，比较精子DNA损伤患者、配偶为RSA患者及健康男性的精液参数，并随访精子DNA损伤患者胚胎发育及RSA发生情况，旨在为临床不育原因分析、预测妊娠结局提供证据补充，现报告如下。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　选择2019年1月—2022年3月佛山市高明区人民医院收治的300例有生育要求的精子DNA损伤患者设为观察组，再选择同期50例精子形态正常但配偶为RSA患者的男性设为流产组，50例有生育要求的健康男性设为对照组。纳入标准：观察组精子DNA损伤患者，有生育要求，年龄23~40岁，配偶年龄23~38岁，患者临床资料完整，且进行精子检查；流产组患者精子正常形态比率≥4%，配偶诊断为RSA患者，非配偶自身疾病因素导致的流产；对照组患者身体健康，有生育要求。排除标准：配偶有生殖道异常、输卵管积水等妇科疾病；夫妻染色体异常；近期有受孕流产史；极度肥胖。其中观察组，不育时间1~7年，平均不育时间（4.12±1.66）年；配偶自然流产次数：1次及以下167例，2次92例，3次及以上41例。流产组配偶自然流产次数：2次37例，3次及以上13例。三组患者和配偶年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经佛山市高明区人民医院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

　　1.2方法

　　1.2.1精液参数检查患者或受检者在取精前禁欲3~7 d，后入院收集精液，保存于37℃恒温水浴箱内，取新鲜精液200μL作为研究样本，放入计算机辅助精子分析系统进行检查，记录精子密度和活力，精子形态采用精子形态快速染色检测正常精子形态百分率。

　　1.2.2精子DNA碎片指数检测精液以磷酸缓冲盐溶液调整精子浓度至（5~10）×106/mL，制作1∶1低熔点琼脂糖凝胶，往制备好的琼脂糖凝胶试管加入30μL精液样本，稀释混匀，37℃常温备用。对载玻片进行4℃平衡预处理，将20μL制作好的精液样本加致载玻片上，盖上盖玻片，注意盖盖玻片沿样本边缘向中心覆盖，避免气泡产生，确定样本制作好后，放置于4℃冰箱中，冷藏5 min左右。后小心移去盖玻片，不要让精液样本大量移除，将载玻片上的精液样本置于酸性DNA变性液中，避光反应7 min左右，再置于裂解液中，室温反应20 min左右。后将其取出，蒸馏水湿润，再将其置于70%、90%、100%的酒精溶液中，每次放置2 min左右，后避光自然晾干。晾干后，往精液样本中心滴加8滴瑞氏染色液与16滴缓冲液，染色15 min，后用蒸馏水冲洗玻片自然晾干。于光学显微镜下观察精子的涂片形态，观察数目约为200个精子。根据精子核与核周围晕轮大小分级，大光晕：核周围晕轮≥精子头横径；中光晕：精子头横径1/3≤核周围晕轮＜精子头横径；小光晕：核周围晕轮≤精子头横径1/3；无光晕：没有发现明显的核周围晕轮；退化精子：没有标准的精子形态。其中DNA损伤精子为小光晕精子、无光晕精子和退化精子，其余为正常精子。精子DNA碎片指数为DNA损伤精子数占比。

　　1.2.3受孕及随访情况精子DNA损伤患者因精子问题经院治疗或药物治疗后，统计自然怀孕例数，精子质量很差、数量很少患者及其配偶于有资质的三级以上医院进行常规超促排卵治疗方案治疗，应用人工授精等辅助生殖技术使配偶成功怀孕。怀孕期间每月进行1次胎儿发育检查，随访跟踪记录直至胎儿停止发育、发生流产或正常分娩为止。

　　1.3观察指标及评价标准

　　1.3.1精液参数比较根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）[6]，检测三组受检者精子密度、精子活力、精子形态。

　　1.3.2精子DNA损伤患者配偶怀孕后胚胎发育情况及RSA发生情况比较记录所有患者配偶成功怀孕（包括自然成功怀孕和应用辅助生殖技术成功怀孕）的胚胎发育情况及RSA发生情况。根据精子DNA碎片指数将观察组患者分为高损伤组（精子DNA碎片指数≥30%）和低损伤组（精子DNA碎片指数＜30%）。比较患者成功怀孕后的胚胎发育情况及RSA发生情况。

　　1.3.3相关性分析分析精子DNA损伤与精子密度、精子活力、精子形态、患者配偶自然怀孕后胚胎发育、RSA发生的相关性。

　　1.4统计学处理

　　采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x-±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，相关性分析使用Pearson分析模型，以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1三组精液参数比较

　　三组精液参数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组精子密度、精子活力、精子形态低于流产组（t=4.530、8.254、14.881，P＜0.001）和对照组（t=18.471、17.965、60.475，P＜0.001），流产组精子密度、精子活力、精子形态低于对照组，差异有统计学意义（t=10.648、7.417、34.823，P＜0.001），见表2。

　　2.2高损伤组与低损伤组患者配偶怀孕后胚胎发育情况、RSA发生情况比较

　　观察组300例患者中，高损伤组127例，其中治疗后自然成功怀孕84例，应用辅助生殖技术成功怀孕43例；低损伤组173例，治疗后均自然成功怀孕。高损伤组治疗后自然成功怀孕配偶胚胎发育停滞率、RSA发生率高于低损伤组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。高损伤组应用辅助生殖技术成功怀孕胚胎发育停滞率为6.97%（3/43），RSA发生率为11.63%（6/43）。

　　2.3精子DNA损伤与精液参数、胚胎发育、RSA发生的相关性分析

　　精子DNA碎片指数与精子密度、精子活力、精子形态呈负相关（P＜0.05），与患者配偶自然怀孕后胚胎发育停滞、RSA发生呈正相关（P＜0.05），见表4。

　　3讨论

　　精子作为父系遗传的载体，其DNA组成结构与体细胞有较大区别，其DNA双链紧密缠绕鱼精蛋白，同时染色质受二硫键交联，具有独特的高度浓缩结构，以防止其DNA受损[7]。但由于吸烟、饮酒、不良生活行为、生活环境等各方面因素的影响，近年来男性DNA损伤患者逐年增多[8]。

　　医学研究表明，在受精过程和胚胎发育过程中，精子及卵子DNA完整性均起着重要作用，部分男性不育患者伴有明显的精液质量异常[9]。本研究发现，观察组精子密度、精子活力、精子形态低于流产组、对照组，流产组上述精液参数低于对照组。说明精子DNA损伤与精液质量参数具有一定相关性，可能与生精过程中细胞异常凋亡、精子染色质包装异常、鱼精蛋白异常等情况有关，也可能与精子生产、成熟、运输、储存时受到氧化应激有关。在精子成熟过程中，未成熟精子对周围环境较敏感，各种致病因素易造成精子DNA损伤，受损精子易被机体清除，进而造成精子数量减少[10]；同时由于吸烟、饮酒等致病原因引起的机体氧化应激，会影响DNA链和染色质，造成其结构异常，而多种致病因素产生的活性氧会导致精子膜脂质过氧化，影响精子膜的流动性，降低精子活动力，还可能影响精子膜完整性，增强精子畸形率，同时严重DNA损伤的精子其线粒体功能会受到影响，呼吸代谢能力降低，精子活力减弱，进而导致精液质量下降[11]。

　　精子DNA不仅与其功能有着显著相关性，还可能影响胚胎正常发育。相关研究表明，即使精子存在DNA损伤，仍可使卵子受精，但不利于受精后的胚胎质量，容易导致后期胚胎发育紊乱，继而导致胚胎发育缺陷或停滞，最终引发流产[12]。本研究结果显示，高损伤组患者配偶自然怀孕后胚胎发育停滞率、RSA发生率均高于低损伤组。说明精子DNA损伤程度越高越易发生胚胎发育停滞和RSA。分析其原因，DNA损伤精子进入卵母细胞后，会激活其修复机制，修复DNA单链断裂，但若修复过程中发生DNA双链断裂，卵母细胞自身功能会受其影响，造成胚胎发育突变；并且卵母细胞修复能力有局限性，若精子DNA损伤严重，可能会导致受精卵细胞异常凋亡，或受精卵自身分裂延迟，造成胚胎发育异常，最终出现不良妊娠结局[13]。

　　本研究还发现，精子DNA碎片指数与精子密度、精子活力、精子形态呈负相关，与配偶自然怀孕后胚胎发育停滞、RSA发生呈正相关。说明精子DNA损伤检测不仅与精液参数有很好的相关性，还可用于预测胚胎发育和临床妊娠结局。但此研究结果还不能完全被证实，因在自然受孕过程中，受孕具有偶然性，其所得的受孕结果并不能准确反映其生育能力。而应用辅助生殖技术成功怀孕的胚胎发育停滞率、RSA发生率均较低，这可能是因为精液DNA损伤患者实施辅助受精时，选择的是精液中发育较好的精子，故减少了精子DNA损伤对胚胎发育的影响。但本研究还存在一定不足，目前难以确定精子DNA损伤与妊娠失败有直接关系，预测临床妊娠结局上不具备科学性，仍需深入研究探讨。

　　综上所述，精子DNA损伤程度越高，其精液质量越差，自然怀孕后越易发生胚胎发育停滞和RSA，临床可通过检测精子DNA碎片指数，评估患者不育发生原因。

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