摘要：为探讨宁夏银北农村地区肉牛布鲁氏菌病的流行病学情况，试验在该地9个村庄开展，随机选择20个未接种布鲁 氏菌疫苗的肉牛养殖场，每场采集20份全血，共400份样品，采用虎红平板凝集试验(RBPT)和竞争酶联免疫吸附试验 ( cELISA)检测肉牛血清抗体情况，再采取实时荧光定量PCR( RT-qPCR)法对血清阳性样品进行检测，将qPCR结果为 阳性的样品进一步采取AMOS-PCR法进行扩增分型。结果表明， RBPT和cELISA整体血清阳性率分别为为23.5%和27.5% ， 2种检测方法之间的Kappa值为0.816 ，一致性较好; RBPT和cELISA检测的群体平均阳性率分别为60%和65% ;qPCR检测显 示，只有5份血清样品布鲁氏菌阳性，经AMOS-PCR鉴定为牛种布鲁氏菌。说明牛种布鲁氏菌是引起该地区牛布鲁氏菌病 的主要病原菌。通过探讨宁夏银北农村地区肉牛布鲁氏菌病的流行病学情况，发现该地肉牛布病具有较高的流行率，且检 测发现感染布病的为牛种布鲁氏菌，为宁夏银北地区控制和预防布鲁氏菌的感染提供流行病学依据。

　　关键词： 农村地区,布鲁氏菌病,肉牛,监测,分析

　　0 引言

　　布鲁氏菌病(布病)是一种呈世界流行的人畜共患 病，主要表现为流产、产奶量减少、胎盘滞留、子宫炎、关节炎和睾丸炎等[1] 。根据WOAHWAHIS数据，除 西欧和北欧的部分国家以及加拿大、日本、澳大利亚和 新西兰被认为是布病净化的国家，其余国家布病仍未根除。现阶段布病主要流行于发展中国家如地中海沿岸、 非洲、南美洲、中东和亚洲等地[2-4] 。《兽医公报》公布 数据显示，布病也已成为我国牛羊最严重的报告疫病， 在2016—2021年，畜间布病报告病例占牛羊所有疾病报 告病例总数的88.2%，在再发阶段，布鲁氏菌病流行范 围持续扩大，发病率呈指数增长，并蔓延32个省，严重 危害人类健康及公共卫生安全[5]。

　　目前，基于细菌学、致病性和宿主嗜性等方面，结 合分子分型与全基因组测序，将布鲁氏菌分为12个生物 种，包括6种“经典”和6种“新发现”，其中对人类致 病性强的包括羊种、牛种、猪种和犬种[6-8] 。布鲁氏菌的 精确鉴定是控制与根除布病的关键，虽然传统的布鲁氏 菌的分离和鉴定是布病诊断的“金标准”，但是不适用 于大规模的流行病学调查[9] 。为了解宁夏银北农村地区 肉牛感染布病的情况，为布病的预防、控制及净化提供 科学依据，本研究采取血清学及分子生物学方法对宁夏 银北地区9个村庄的肉牛感染布鲁氏菌情况进行监测， 以评估流行病学情况，以期为后期科学防控提供依据。

　　1 材料

　　1.1 样本

　　2022年11月，从宁夏银北地区9个村庄20个养殖场各采集20份肉牛全血共计400份样品。

　　1.2 主要试剂

　　虎红平板凝集试验抗原，购自哈药集团生物疫苗 有限公司; c ELISA试剂盒、布鲁氏菌荧光定量PCR 检测试剂盒，购自青岛立见生物科技有限公司;动物 病毒DNA/RNA快速提取试剂盒，购自西安天隆科技 有限公司; AMOS-PCR 引物序列，购自华大基因; 2 ×TransTaq®-T PCR SuperMix，购自北京全式金生物技 术股份有限公司。

　　1.3 主要仪器

　　生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司生产;酶 标仪、 PCR扩增仪、紫外凝胶成像系统，美国伯乐公司 生产生产;生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司生 产;全自动核酸提取仪，西安天隆科技有限公司生产; 实时荧光PCR仪，德国耶拿公司生产;电泳仪，北京 六一仪器厂生产。

　　2 方法

　　2.1 血清学检测

　　血液样本经离心分离后取上血清，采取RBPT+cELISA 方法进行检测。 RBPT操作方法及结果判定严格参照国 标GB/T8646—2018规定执行， cELISA按照试剂盒说明 进行操作及结果判定。

　　2.2 RT-qPCR

　　对于血清学阳性样本采取RT-qPCR法进行病原学检 测，具体操作方法严格按照试剂盒说明书执行。

　　2.3 AMOS-PCR

　　以RT-qPCR判定的阳性样本DNA为模版，用布鲁氏 菌属鉴定引物IS711插入序列为基础设计AMOS-PCR引 物，引物序列见表1.依据文献[10]使用的引物序列和扩增 参数进行扩增，产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

　　3 数据的统计分析

　　本次实验数据用 EXCEL 做基础整理，再使用 SASS27.0进行统计分析。

　　4 结果

　　4.1 牛布鲁氏菌的血清学检测

　　牛布鲁氏菌个体血清学检测结果见表2.结果显 示， 9个村庄RBPT个体平均阳性率为23.5% ，cELISA 平均阳性率为27.5%，其中Ⅳ村RBPT 、cELISA阳性率 均为最高，均达55%。采用Kappa一致性检验比较所有 检测血清样本的RBPT和cELISA结果，见表3.结果表 明， 2项检验之间的Kappa值为0.816 ，一致性较好，其 中RBPT阳性样品cELISA基本也为阳性。牛布鲁氏菌 群体检测结果见表4.结果显示， 9个村庄RBPT群体平 均阳性率为60% ，cELISA平均阳性率为65%，除Ⅶ村 RBPT 、cELISA群体阳性不一致外，其余村庄群体阳性 率均一致。

　　4.2 RT-qPCR检测

　　对于血清学阳性样本采取RT-qPCR法进行病原学检 测，结果见图1.结果显示，有5份血清样品布鲁氏菌 阳性， Ct值在26.93 ～ 33.14.其中5份血清样品RBPT和 cELISA检测均为阳性。

　　4.3 布鲁氏菌的AMOS-PCR鉴定

　　用IS711引物对上述RT-qPCR阳性样品做进一步的 AMOS-PCR扩增， PCR产物经1.5%琼脂凝胶电泳检测， 以DL2000 DNALadder为标准，结果显示，阳性样品均 扩增得到498 bp条带，与牛种布鲁氏菌分子量一致，鉴 定为牛种布鲁氏菌。

　　5 讨论

　　畜牧业是宁夏的传统产业，也是当地农村经济的支 柱产业，畜牧养殖已是其经济增长的主要来源。然而， 关于农村地区布病的流行病学调查及病原学研究较少。 本次研究结合血清学和分子生物学方法对宁夏银北地 区9个村庄牛感染布病情况进行分析，血清学调查结果 证实了在宁夏银北农村地区肉牛中布病的流行， 60%以 上的村庄中均有不同程度的感染，此项研究中由于牛 均未接种过布鲁氏菌疫苗，血清呈阳性是由于自然暴 露， RBPT法和cELISA法检测牛血清中布鲁氏菌的总阳 性率分别为23.5%和27.5%。研究报道，宁夏彭阳县未免 疫肉牛布病cELISA结果显示，平均个体阳性率为5% ， 最高达24.4%，平均场户表观流行率为11.8%，最高达 53.8%[11] ;新疆某偏远地区3个规模牧场未免疫牛布病感 染情况显示， RBPT阳性率为6.8%[12] ;埃及北部6个村庄 未接种布鲁氏菌疫苗的家牛RBPT和iELISA血清阳性率 为20.7%和23.7%[13] 。数据表明，宁夏银北地区肉牛养殖 量虽然不大，但其布病血清阳性率普遍高于其他地区， 可能是由于该地与内蒙交界，交通发达，活畜交易频 繁，肉牛感染风险变大。

　　本研究中， RBPT阳性94份， cELISA阳性110份， Kappa值为0.816. 符合率较好。白鸽等[14]研究不同血 清学方法在奶山羊布病诊断中的比较，以试管凝集试 验( SAT )为基准， RBPT 、cELISA的符合率分别为 98.33%和98.75%，敏感性为96.67%和100% ，Kappa值为 0.870和0.902.证实cELISA在符合率、敏感性及Kappa 检验一致性均为最好，此外， RBPT和cELISAKappa值 为0.818.与本次实验结果一致。李展等[15]分析研究了 牛布病的不同检测方法，结果显示， RBPT阳性20份， cELISA阳性46份，得出cELISA敏感性高，适用于养殖 场布病的流行病学调查及净化工作。 RBPT检测的抗体 类型主要为IgG ，cELISA检测的抗体类型为IgM和IgG 。 对于一份早期感染的血清而言，当IgM和IgG的总量达到 50 IU/mL，在cELISA中就会表现为阳性，因此cELISA 相对于其他方法，其敏感性更高，可能会检测出更多的 阳性样品[16]。

　　对于血清学阳性样本采取RT-qPCR法进行病原学 检测， 结果显示，只有5份血清样品布鲁氏菌阳性或可 疑。 一项在巴基斯坦的研究表明，在SAT和ELISA分别 检测的布病血清阳性率为9.2%( 8/87)和10.3%(9/87)的 情况下，只有1份ELISA阳性样本扩增出流产布鲁氏菌 DNA [17] 。谭勤琴等[18]在调查一起布病聚集性疫情时研 究发现，从16份疑似患者全血标本只分离出5株疑似布 鲁氏菌，从19份疑似病羊全血标分离出1株疑似布鲁氏 菌。 Sankhe S S等[19]在调查绵羊山羊布鲁氏菌发病情况 时发现， 通过IS711/BMPCR ，22.73%阳性全血和14.49%

　　阳性血清样本可产生731 bp的扩增子，证实存在羊种 布鲁氏菌。 qPCR检测不出血清阳性动物的布鲁氏菌 DNA，可能是由于这些动物曾感染过，但在采集血样时 缺乏菌血症。研究报道，对于血液样本而言，血沉棕黄 层和全血是PCR检测布鲁氏菌的最佳样本，血清样本由 于载菌量低或没有布鲁氏菌DNA而被认为是不合适的 选择[20]。

　　AMOS-PCR是布鲁氏菌种型鉴定应用最广泛的方法 之一，据报道，该方法根据可变转座子IS71l基因在不 同布鲁氏菌种之间的差异，可鉴定羊种布鲁氏菌( 1 、 2 、3型， 731 bp )，牛种布鲁氏菌( 1 、2 、4型， 498 bp)，猪种布鲁氏菌( 1型， 285 bp)和绵羊附睾种布鲁 氏菌( 96l bp )[21-22] 。本实验经AMOS-PCR检测阳性样 品，均得到498 bp，为牛种布鲁氏菌。杨琴等[12]研究发 现，在牛流产胎儿、牛生鲜乳样品阳性中均可鉴定出羊 种布鲁氏菌。黄天鹏等[22]在牛体表采集的寄生蜱样本中 分离到的布鲁氏菌也均为羊种布鲁氏菌。羊种布鲁氏菌 致病力和侵袭力均强，成为世界范围内的流行菌种，但 是本研究只鉴定出牛种布鲁氏菌，未获得其它种型的布 鲁氏菌，但不排除其的存在，这可能与采集的样本等因 素有关，有待进一步研究。

　　6 结论

　　本研究揭示了在宁夏银北农村地区未接种疫苗的肉 牛血清中布鲁氏菌抗体阳性率较高，且RBPT和cELISA 检测方法一致性较好，通过AMOS-PCR鉴定，该地多为 牛种布鲁氏菌。下一步，将进行更多的流行病学研究和 基因分型等，为制定适合的布病预防控制措施提供科学 依据。

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