摘要：该试验通过PCR方法检测27株广西凡纳滨对虾源创伤弧菌中耐药基因ant(3”)-I、aac(3)-II、sul1、tet(A)、tet (C)和TEM的携带情况。结果表明，27株创伤弧菌中，ant(3”)-I、aac(3)-II、sul1、tet(A)、tet(C)和TEM基因的检出率分别为0% ( 0/27 )、0% ( 0/27 )、55.6% ( 15/27 )、70.4% ( 19/27 )、81.5% ( 22/27)和51.9% ( 14/27 );共包含7种耐药基因型，其中优势耐药基因型为ant(3”)-I-aac(3)-II-sul1+tet(A)+tet(C)+TEM+。

　　关键词： 凡纳滨对虾,创伤弧菌,耐药基因,检测

　　0 引言

　　凡纳滨对虾具有耐高温、耐低盐、生长快、抗病性 强、肉质鲜美、养殖密度高、营养需求低等优点，因其 具有较高的经济价值，凡纳滨对虾产业已成为广西水产 养殖业的支柱产业之一[1] 。但伴随着凡纳滨对虾产业的迅猛发展，凡纳滨对虾弧菌性疾病常暴发流行，造成了 养殖经济的损失巨大，严重制约该产业的可持续发展。 创伤弧菌属于弧菌科、弧菌属，是一种重要的水生动物 病原菌，也是一种人类条件致病菌[2-3] ，不仅可导致水生 动物大量死亡[4] ，还可导致人类坏死性筋膜炎和败血症等疾病[5] 。目前，水生动物弧菌病的治疗手段主要是使 用抗生素。由于部分养殖户使用抗生素不科学等原因， 创伤弧菌耐药问题日益突出[6-7] 。细菌对抗生素形成耐 药与耐药基因密切相关，例如氨基糖苷类耐药基因ant (3”) -I、aac(3)- Ⅱ的编码蛋白可对氨基糖苷类抗 生素的羟基或氨基进行修饰从而干扰抗生素作用于细菌 核糖体[8] ;磺胺类耐药基因sul1的编码蛋白可引起二氢 叶酸合成酶与磺胺类抗生素的结合位点发生改变，使细 菌出现耐药性[9] ;四环素类耐药基因tet(A)和tet(C) 可介导细菌对四环素类抗生素的外排作用[10] ; β-内酰胺 类耐药基因TEM可介导革兰氏阴性菌对β-内酰胺类抗 生素耐药[9] 。本试验对分离自广西沿海养殖凡纳滨对虾 的27株创伤弧菌进行耐药基因ant(3”)-I、aac(3)- II、sul1、tet(A)、tet(C)和TEM的检测及分析，为 凡纳滨对虾创伤弧菌疾病防控提供科学指导，为创伤弧 菌耐药机制的深入研究提供基础数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　试验菌株为实验室于2022—2023年从广西沿海患病凡纳滨对虾中分离的27株创伤弧菌CS01 ～ CS27.在试 验前均已再次进行API生理生化鉴定和16S rRNA分子生 物学鉴定。细菌基因组DNA提取试剂盒和PCR反应预混酶 2×Taq MasterMix均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

　　1.2 细菌DNA的提取及耐药基因PCR检测

　　参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书来提取细 菌总DNA。耐药基因ant(3”)-I、aac(3)-II、sul1、 tet(A)、tet(C)和TEM的PCR扩增引物(表1 )由英 潍捷基(上海)贸易有限公司合成。 25 µL的PCR反应 体系： DNA模板1 µL， 上、下游引物各1 µL ，2 ×Taq Master Mix 12.5 µL，灭菌去离子水9.5 µL 。PCR反应程 序设置为94 ℃预变性5 min;94 ℃ 40 s，退火30 s(退火 温度见表1 )，72 ℃延伸90 s ，35个循环; 72 ℃充分延 伸10 min。以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，将符 合预计片段长度的PCR产物送北京六合华大基因科技有 限公司进行测序。

　　对未出现预期电泳条带的菌株，以表1退火温度为 中心温度±5 ℃再做梯度PCR并调试其它条件，反复试 验仍无预期条带出现者视为所检测基因为阴性。

　　1.3 序列分析

　　以DNAStar的Megalign软件计算耐药基因序列的 同源性。采用ClustalX进行序列完全比对分析后，以 Mega11软件的邻接法构建进化树， Bootstrap重复1 000 次检验其可信度。

　　2 试验结果

　　2.1 耐药基因的PCR检测结果

　　对27株创伤弧菌进行耐药基因ant(3”) -I 、aac (3 )-II 、sul1、tet(A )、tet(C )和TEM的PCR检 测，结果表明部分受试菌株可扩增出大小约为408 bp的 sul1基因片段、 387 bp的tet(A)基因片段、 418 bp的tet ( C )基因片段和800 bp的TEM基因片段(图 1 ～图 4) ，与预计片段长度一致。将阳性PCR产物送测序，其 测序结果经比对确认这些产物片段为sul1、tet(A)、tet(C)和TEM基因的序列片段。经反复PCR检测， 27株 创伤弧菌均未扩增出ant(3”) -I和aac(3 )- Ⅱ基因 片段。

　　根据PCR检测结果， 27株创伤弧菌中耐药基因ant (3”) -I 、aac(3 )-II 、sul1 、tet(A )、tet(C ) 和TEM 的检出率分别为0%( 0/27 )、 0%( 0/27 )、 55.6%( 15/27 )、 70.4%( 19/27 )、 81.5%( 22/27 ) 和51. 9%( 14/ 27 )。共包含7 种耐药基因型，即ant (3”)-I-aac(3)-II-sul1-tet(A)+tet(C)+TEM- 、 ant( 3”) -I-aac( 3 )-II-sul1+tet(A )+tet(C )+ TEM- 、ant(3”) -I-aac(3 )-II-sul1+tet(A )+tet ( C )+TEM+、ant( 3”) -I-aac( 3 )-II-sul1-tet (A )-tet(C )-TEM+ 、ant(3”) -I-aac(3 )-II- sul1-tet(A)+tet(C)+TEM+、ant(3”)-I-aac(3)- II-sul1-tet(A )-tet(C )+TEM+和ant(3”) -I-aac (3)-II-sul1+tet(A)-tet(C)-TEM- ，检出率依次 为18.5%( 5/27 )、 18.5%( 5/27 )、25.9%( 7/27 )、 7 . 4%( 2/27 )、 7 . 4%( 2/27 )、 11 . 1%( 3/27 )和 11.1%( 3/27 )(表2 )。其中，优势耐药基因型为ant (3”)-I-aac(3)-II-sul1+tet(A)+tet(C)+TEM+。

　　2.2 耐药基因的序列分析

　　随机选取菌株CS08构建sul1基因序列进化树(图 5 )，可见CS08与肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) CP100658.1和CP100655.1、贺氏肠杆菌( Enterobacter hormaechei )CP133857.1、肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae)OQ785271.1和OQ785270.1、铜绿假单胞菌 ( Pseudomonas aeruginosa)CP133754.1聚为一支，在进 化关系上比较近。 CS08的sul1基因序列与这些序列的同 源性均为95.9%。

　　随机选取菌株CS06构建tet(A )基因序列进化树 (图6)，可见CS06与铜绿假单胞菌CP120705.1、恶臭 假单胞菌(Pseudomonas putida)CP132007.1、嗜麦芽窄食 单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)CP104292.1和大 肠杆菌OU349840.1聚为一支，在进化关系上比较近。 CS06 的tet(A)基因序列与这些序列的同源性均为100%。

　　随机选取菌株CS02菌株构建tet(C)基因序列进化 树(图7 )，可见CS02与霍乱弧菌(Vibrio cholerae) CP 033514 . 1 、铜绿假单胞菌CP 120705 . 1 、大肠杆 菌MN057686.1、大肠杆菌MN053930.1、大肠杆菌 LC542972.1、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) CP050522.1和肠炎沙门氏菌CP048299.1聚为一支，在进 化关系上比较近。 CS02的tet(C)片段基因序列与这些 序列的同源性均为99.8%。

　　随机选取菌株 CS24 菌株构建TEM基因序列进 化树(图 8 )，可见 CS 24与嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus )D29979.1、枯草 芽孢杆菌( Bacillus subtilis )LT622642.1、安全芽 孢杆菌( B. safensis )MW647491.1、韦氏芽孢杆菌 (B. weihenstephanensis )CP009746.1、枯草芽孢杆菌 CP045673.1 、热带芽孢杆菌(B. tropicus)CP041081.1聚 为一支，在进化关系上比较近。 CS24的TEM序列与这 些序列的同源性在98.5% ～ 98.9%。

　　3 讨论

　　弧菌病已成为制约凡纳滨对虾养殖稳定生产的重要 因素之一。创伤弧菌不仅可引起水生动物大量死亡[4] ， 还常导致人类发生各种食源性疾病[5] 。由于部分养殖户 滥用抗生素或养殖水体遭受到污染等原因，许多水产养 殖地区的创伤弧菌存在耐药现象。针对创伤弧菌的耐药 基因检测对于创伤弧菌的疾病防控具有重要意义。 本试 验结果， ant(3”) -I、aac(3)-II、sul1、tet(A)、 tet(C)和TEM在广西凡纳滨对虾源创伤弧菌中的检出 率分别为0% 、0% 、55.6% 、70.4% 、81.5%和51.9%。与 其他研究相比， ant(3”) -I的检出率低于广西凡纳滨 对虾源副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检出率 ( 6.7% )[1] ;aac(3)- Ⅱ的检出率低于山东雏鸭源大肠 杆菌的检出率[15]( 50% );sul1的检出率均高于安徽和 江苏等地的猪源大肠杆菌[16]( 24.08% )、广西凡纳滨 对虾源副溶血弧菌[17]( 25%)、江苏和上海等地的海水 养殖源弧菌[18]( 12.2% )的检出率; tet(A) 的检出率 高于上海郊区、江苏、福建以及海南虾源副溶血弧菌[19] ( 16.7% )和天津虾肠道菌株[20]( 35.4% )的检出率， 与宁德大黄鱼源哈维氏弧菌[21]( 81.5 )的检出率相同; tet(C) 的检出率比江苏沿海地区水产养殖源温和气单 胞菌[22]( 33.33% )、四川斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌[23] ( 9.52% )的检出率高; TEM的检出率比上海凡纳滨对 虾源副溶血弧菌[24](23.81%)、广西凡纳滨对虾源副溶 血弧菌[1]( 13.3%)的研究结果高，比宁波[25]海产品及环 境中的副溶血弧菌( 91.7% )的检出率低。造成各种来 源细菌中几种耐药基因检出率不同的原因可能与细菌宿主 及所处环境、检测条件等不一致有关。尽管本试验未对创 伤弧菌耐药表型与耐药基因的相关性进行分析，但sul1、 tet(A)、tet(C)和TEM基因较高的检出率给广西凡纳 滨对虾创伤弧菌疾病防控带来的风险仍需引起高度重视。

　　进化树分析结果， CS08 的sul1基因序列与铜绿 假单胞菌CP133754.1、肠炎沙门氏菌CP100658.1和 CP100655.1、贺氏肠杆菌CP133857.1、肺炎克雷伯菌 OQ785271.1和OQ785270.1的sul1基因序列核苷酸同源 性均为95.9% 。CS06的tet(A)基因序列与铜绿假单胞 菌CP120705.1、恶臭假单胞菌CP132007.1、嗜麦芽窄食 单胞菌CP104292.1、大肠杆菌OU349840.1的tet(A)基 因序列同源性均为100% 。CS02的tet(C)基因序列与 铜绿假单胞菌CP120705.1、霍乱弧菌CP033514.1、大 肠杆菌MN057686.1、大肠杆菌LC542972.1、天蓝色链 霉菌CP050522.1、肠炎沙门氏菌CP048299.1、大肠杆 菌MN053930.1的tet(C)基因序列同源性均为99.8% 。 CS24的TEM基因序列与枯草芽孢杆菌LT622642 . 1 、 嗜热脂肪地芽孢杆菌 D29979 . 1 、安全芽孢杆菌 MW647491.1、韦氏芽孢杆菌CP009746.1、枯草芽孢杆菌CP045673.1、热带芽孢杆菌CP041081.1的TEM基因序 列同源性在98.5% ～ 98.9%，推测这些sul1、tet(A) 、 tet(C )和TEM基因序列可能分别具有各自共同的起 源，并具有在不同地区、不同宿主或不同种属菌株之间 进行广泛传播的能力。由于耐药基因可以随可移动遗传 组件在菌株之间水平转移[8] ，凡纳滨对虾养殖水环境容 易被携带耐药基因的细菌污染，成为细菌交流耐药基因 的温床。因此，建议继续加强凡纳滨对虾源创伤弧菌耐 药基因的监测，以提高凡纳滨对虾创伤弧菌病防控效 率，预防创伤弧菌耐药性的产生。

　　4 结论

　　27 株广西凡纳滨对虾源创伤弧菌中耐药基因ant (3”) -I、aac(3)-II、sul1、tet(A) 、tet(C)和 TEM的检出率分别为 0% 、0% 、55.6% 、70.4% 、81.5% 和51.9%，共包含7种耐药基因型，其中优势基因型为ant (3”)-I -aac(3)- Ⅱ-sul1+tet(A)+tet(C)+TEM+ ， 其检出率为25.9%。

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