摘要：为制备马疱疹病毒1型( EHV-1 )UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基 因组序列，采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体，经Western blot 与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示，纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应; pUL56多克隆抗体 的效价为1 :128 000.并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体，为pUL56功能特性 及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。

　　关键词： 马疱疹病毒1型,UL56蛋白,原核表达,多克隆抗体

　　0 引言

　　马疱疹病毒1型( EHV-1 )是马鼻肺炎的病原体之一，在马群中广泛流行，大多数马匹在幼年时被感染并在其体内建立终生潜伏。 EHV-1具有很强的传染性，马属动物感染后主要表现为孕马流产、新生马驹死亡、视 网膜脱落、呼吸系统和神经系统等多种临床症状，对马 产业发展造成了巨大的影响[1-2] 。由于EHV-1使用多种机 制逃逸宿主免疫反应，尚未开发出完全保护性疫苗和有 效的抗病毒药物，使其目前仍是世界各地重点防控的马 匹急性传染病[3-4] 。由细胞毒性T淋巴细胞( CTL)介导 的免疫对于防御细胞相关病原体至关重要， CTLs与主 要组织相容性复合物I类( MHC-I )相互作用，继而有 效识别和破坏被病毒感染的细胞[5-6] 。然而，大多数疱疹 病毒已进化出一系列逃逸机制，它们通过下调细胞表面 MHC-I分子的表达以避免CTL识别，实现逃逸宿主免疫 反应， EHV-1同样使用该逃逸策略[7]。

　　研究发现， EHV-1的UL56蛋白(pUL56)是一种磷 酸化的早期蛋白，由ORF1编码[8] 。该蛋白在MHC-I下 调过程中发挥着主要作用，但是其具体机制尚未明确， 为此pUL56在EHV-1逃逸宿主免疫过程的作用需要进一 步研究。本研究拟以EHV-1本地流行株YM2019株为研 究对象，对pUL56进行原核表达，以纯化的重组蛋白免 疫BALB/c小鼠制备pUL56的多克隆抗体，为深入研究 pUL56的功能奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 毒株、载体、细胞和试验动物

　　EHV-1 YM2019株、 pET-32a表达载体和EHV-1阳性 血清均由本研究室保存; Trans5 α和Transetta( DE3 ) 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司; SPF级6 周龄雄性BALB/c小鼠购自新疆医科大学动物实验中心。

　　1.2 主要试剂

　　2 ×Es Taq Master Mix( Dye )购自北京康为世纪 生物科技有限公司;限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR I 、 pMD19-T Vector和T4 DNA Ligase购自宝日医生物技术 (北京)有限公司; DNA胶回收和质粒提取试剂盒购自 OMEGA公司; Ni-NTA纯化树脂购自生工生物工程(上 海)股份有限公司; Goat Anti-Mouse IgG(H+L )-HRP antibody购自biosharp公司;弗氏完全佐剂和不完全佐剂 购自Sigma公司。

　　1.3 UL56基因的克隆

　　根据GeneBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列 ( GenBank ：MT063054)，设计UL56全长基因的特异 性引物， UL56-F ：5 ′-AAAGGAGTGCATGTA-3 ′， UL56 ：5 ′-CCACGCTGGATCCATG-3′，预期扩增片 段大小为609 bp 。PCR扩增反应体系( 50 µL )：2 ×Es Taq Master Mix(Dye)25 µL，上下游引物( 10 μmol/L ) 各2 µL ，DNA模板2 µL ，ddH2O 19 µL。反应程序： 94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s ，54 ℃退火30 s ，72 ℃ 延伸30 s ，35个循环; 72 ℃延伸10 min。使用胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD19-T载体连接并转化至 Trans5 α感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒鉴定， 将鉴定正确的质粒送至公司测序。

　　1.4 生物信息学分析

　　使用DNAstar软件对UL56基因进行同源性分析; MEGA7软件绘制UL56基因遗传进化树; Signal P 5.0 、 TMHMM 2.0和DNAstar软件分析pUL56信号肽、跨膜区和结构特征。

　　1.5 pET-32a-UL56表达载体的构建

　　设计扩增UL56基因片段的特异性引物， pUL56-F ： 5 ′-CG GGATCCATGAGGAGGCGCATACACG-3 ′ (下划线为BamH Ⅰ酶切位点) ，pUL56-R ：5 ′-CG GAATTCTTACTTCCTGCAAAAGGTT-3′(下划线为 EcoR I 酶切位点)，预期扩增长度为509 bp 。PCR反应 条件和反应程序参照1.3部分，使用BamH Ⅰ和EcoR I 酶分别对目的片段和pET-32a表达载体进行酶切，经T4 DNA Ligase连接并转化至Trans5α感受态细胞中，提取 质粒进行PCR、双酶切及测序鉴定，将验证正确的重组 质粒命名为pET-32a-UL56.

　　1.6 pUL56的原核表达

　　将重组质粒pET-32a-UL56转化至Transetta( DE3 ) 感受态细胞中，挑取单克隆接种至含氨苄抗性的LB液体 培养基中， 37 ℃, 180 r/min条件下过夜培养，再将过夜 培养的菌液按照1 :100比例接种到LB培养基中，培养至 OD600 nm值为0.6 ～ 0.8时，加入IPTG (终浓度0.2 mmol/L ) 诱导表达，分别收集诱导2 、3 、4 、5 、6 h的菌体，超声 破碎菌体并进行SDS-PAGE分析，分析pUL56的最佳诱 导时间和可溶性。

　　1.7 pUL56的纯化和Western blot鉴定

　　大体积诱导pET-32a-UL56重组表达菌，离心收集后 加入裂解液，置于冰上超声破碎。按照Ni-NTA琼脂糖 树脂说明书纯化pUL56.完成后将蛋白装入透析袋，依 次在浓度为6 、4 、2 mol/L尿素中复性，时间均为12 h ， 经SDS-PAGE电泳验证后， -80 ℃保存备用。

　　将纯化的pUL56进行SDS-PAGE电泳， 结束后转印 至PVDF膜，加入5%脱脂乳， 37 ℃封闭2 h;PBST洗涤 3次，加入EHV-1阳性血清( 1 :100稀释)， 37 ℃孵育 2 h;PBST洗涤3次，加入Goat Anti-Horses IgG(H+L )- HRP antibody( 1 :10 000稀释)， 37 ℃孵育1 h;PBST 洗涤3次，使用ECL化学发光溶液显色。

　　1.8 pUL56多克隆抗体的制备

　　将纯化后的pUL56与等体积的弗氏完全佐剂乳化 后，免疫6周龄雄性BALB/c小鼠( 100 μg/只);第 14 、28天分别进行二免和三免，蛋白与弗氏不完全佐剂 乳化。每次免疫前采集血液并分离血清， -20 ℃保存备用。

　　1.9 pUL56多克隆抗体的效价测定

　　将纯化的pUL56包被ELISA反应板( 5 μg/孔)， 4 ℃过夜; PBST 洗涤3 次，加入5% 脱脂乳， 37 ℃ 封闭 1 h ;PBST洗涤3次，加入倍比稀释的小鼠血清 ( 1 ∶ 500 ～ 1 ∶ 512 000 ) ，免疫前的小鼠血清作为阴 性对照; PBST洗涤3次，加入Goat Anti-Mouse IgG (H+L )-HRP antibody ;PBST洗涤3次，加入TMB工作 液避光显色， H2SO4(2 mol/L)终止显色，测定OD450 nm 值。P为阳性血清的OD450 nm值，N为阴性血清的OD450 nm 值， P/N≥2.1时判断为阳性，反之为阴性。

　　1.10 pUL56多克隆抗体的反应性鉴定

　　将纯化的pUL56作为抗原， pUL56多克隆抗体作 为一抗，免疫前的小鼠血清作为阴性对照， Goat Anti- Mouse IgG( H+L )-HRP antibody作为二抗，进行 Western Blot试验，鉴定多克隆抗体的反应性。

　　1.11 pUL56多克隆抗体的应用

　　培养RK-13细胞，待其密度达到70% ～ 80%后， 将重组质粒pcDNA3.1-UL56和空载体pcDNA3.1转染 分别转染至细胞中， 48 h后收集细胞样品;将pUL56 多克隆抗体作为一抗， Goat Anti-Mouse IgG( H+L )- HRP antibody作为二抗，进行Western Blot试验，以此 判定pUL56多克隆抗体能否检测到RK-13细胞表达的 pUL56.

　　2 结果

　　2.1 UL56全长基因的扩增结果

　　以EHV-1基因组为模板， PCR扩增出大小为609 bp 的片段，与预期大小相符，见图1.

　　2.2 生物信息学分析

　　2.2.1 UL56基因分析

　　测序结果表明， UL56基因的核苷酸序列未发生突 变;遗传进化分析结果显示， UL56基因与26株马源 性毒株的基因相似性为100%;与野驴源毒株5586 、 瞪羚源毒株94-137和斑马源毒株T-616的相似性分别是 98.4% 、95.1% 、95.1% ;该基因在马源性毒株间具有很 高的保守性，其变异主要与宿主进化相关，见图2.

　　2.2.2 pUL56的二级结构、跨膜区及信号肽分析

　　氨基酸序列分析表明， pUL56含有203个氨基酸;全 蛋白具有丰富的抗原区域，见图3A;第 1 ～ 168位氨基酸 处亲水性，表面可及性较好，且具有较高的抗原性，第 170 ～ 192位氨基酸处为跨膜螺旋结构域，见图3B;不存 在信号肽位点，见图3C。

　　2.3 pET-32a-UL56表达载体的鉴定

　　以pET-32a-UL56表达载体为模板， PCR扩增得到 509 bp的片段，见图4A;用EcoR I和BamH Ⅰ 酶对pET- 32a-UL56表达载体酶切，获得5 900 bp和509 bp的片段， 见图4B，大小均与预期相符，表明成功构建pET-32a - UL56表达载体。

　　2.4 pUL56的表达、纯化及Western blot鉴定

　　pUL56 在诱导3 h 时表达量最高，相对分子质量 为35 kDa，与预期一致，并以包涵体形式存在，见图 5 ;通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的pUL56.见图 6A，可以与EHV-1阳性血清特异性结合，见图6B，表明 pUL56具有良好的反应原性。

　　2.5 pUL56多克隆抗体效价及反应性测定

　　间接ELISA 结果显示，小鼠血清的稀释度超过 1 :128 000时P/N<2.1.表明pUL56多克隆抗体效价为1 :128 000.见图7 ;Western blot结果显示，多克隆抗 体能与纯化的pUL56结合，呈现出单一的蛋白条带，但 不与阴性血清反生反应，见图8.表明pUL56多克隆抗 体具有良好的反应性。

　　2.6 pUL56多克隆抗体应用

　　Western blot结果显示， pUL56多克隆抗体能与转 染pcDNA3.1-UL56重组质粒的细胞样品发生反应， 产生特异性的蛋白条带，大小也与预期相符;而转染 pcDNA3.1空载体的细胞样品未检测到该条带，表明 pUL56多克隆抗体可用于检测细胞中表达的pUL56.见 图9.

　　3 讨论

　　1936年， Dimock W W和Edwards P R[9]首次从流产 胎儿的肺组织中分离出EHV-1.国内于1982年分离到该 病毒[10] 。随后，罗蔼剑等[11]对我国11个省进行了流行病 学调查，结果显示，血清阳性率最高可达70.83%。目 前尚无特效药物治疗该病，此外，我国的EHV-1疫苗仍 然处于实验室研发阶段，所以只能依赖进口的商品化疫 苗。与大多数疱疹病毒一样， EHV-1利用其基因产物在 多个水平上阻断免疫反应[12-13] ，这为EHV-1有效疫苗的 研发带来阻碍。

　　EHV-1感染马匹后首先在呼吸道上皮细胞中开始复 制，然后进入血液中的外周血单核细胞，引起细胞相关 的病毒血症[14] 。马匹表现的流产和神经症状的主要原因 是EHV-1在妊娠子宫和中枢神经系统的内皮细胞中形成 血栓[15]。研究发现，pUL56在调节呼吸道上皮的抗原呈 递、细胞因子表达和趋化性中的发挥着重要作用[16] 。将 EHV-1 Ab4神经致病性毒株的UL56基因缺失后，病毒 在细胞内的增殖效价不受影响，但其对马匹的致病力明 显下降，主要表现为马匹的发热症状和鼻腔排毒量均减 少。当野毒感染后，该基因缺失毒株也具有良好的免疫 保护效果[17-18] 。以上研究结果表明， pUL56的功能特性 与EHV-1的传播有着密切的联系，因此， UL56基因具 有潜在的研究价值，可作为基因缺失疫苗研究的候选基因。

　　研究发现， EHV-1病毒全蛋白抗体可有效抑制T细 胞对有丝分裂原的反应。 pUL56在调节丝裂原活化蛋白 激酶中发挥重要作用，因此该蛋白可能参与该机制[19] 。 本研究所制备的多克隆抗体可用于验证pUL56在抑制T 细胞反应中的发挥的作用，以揭示该蛋白在EHV-1逃逸 宿主免疫过程的功能。

　　本研究选用高效克隆和表达的pET载体，通过大肠 杆菌表达系统获得重组蛋白，使蛋白的原核表达变得 简单和快捷，同时也降低了成本。但是大肠杆菌表达系 统也存在一些不足之处，例如目的蛋白以包涵体的形式 存在。在本研究的蛋白原核表达过程中通过降低诱导温 度、更换表达载体或调整IPTG的浓度，均未改变蛋白的 表达形式。皮下免疫动物存在最大剂量限制，然而包涵 体蛋白经过多次洗涤和透析复性后损失量较大，使其浓 度严重降低。为此本研究采用超滤离心管浓缩蛋白解决 了蛋白浓度较低的问题。

　　4 结论

　　本研究掌握EHV-1 YM2019株UL56基因的生物信息学特性，获得纯化的pUL56并制备出免疫反应强且特异性高的pUL56多克隆抗体，为pUL56的功能特性以及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。

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