摘要： 马头山羊是武陵山脉的地方良种， 以个体较大， 肉和板皮质量优良而著称，是湖北省重点保护的品种。本研究选取 性别不同的1岁马头山羊作为试验对象，利用纤维蛋白酶消化法建立马头山羊耳部组织成纤维细胞系，并分析、比较成纤维 细胞不同天数生长形态、生长曲线和冻存前后存活率等生物学特征。结果表明，培养48 h后，可观察到组织块周围有许多 典型成纤维细胞形态的细胞环绕生长，细胞倍增时间约为24 h，细胞冻存后的复苏率分别为96.0%和96.5%，细胞生长呈现 出典型的“S”形。此细胞系的建立为马头山羊遗传资源保护及其他研究提供理想的试验材料。

　　关键词： 马头山羊,成纤维细胞,组织培养

　　0 引言

　　马头山羊是恩施州内肉羊养殖的主要品种，以个体 较大，肉和板皮质量优良而著称，其肉用性能好，在全 年放牧的情况下， 12月龄阉羊体重可达40 kg左右， 18月 龄可达50 ～ 60 kg，如适当补料，可达80 ～ 90 kg 。12月 龄屠宰率为57.87%，肉质细嫩，味道鲜美。马头山羊板 皮质地优良，结构致密，拉力强、弹性好、油性足，为 重要的出口物资，也是重要的试验材料。

       目前，优良畜禽的选育主要采用“优胜劣汰”的模 式，周期较长、需要饲养的种羊多而提高选育成本，制约了遗传改良的步伐。 1996年，利用体细胞克隆技术培 育的克隆羊“多莉”在英国问世，“多莉”的性状与提 供体细胞的母体相同，这为培育性状优良的畜禽提供依 据。成纤维细胞是结缔组织中的主要细胞之一，拥有动 物完整的遗传信息，易获得且对动物伤害不大，体外培 养增殖较快，是进行体细胞克隆的理想细胞系。建立和 保存性状优良马头山羊的成纤维细胞系对快速扩繁出大 量优秀的马头山羊意义重大。

　　本研究选取性别不同的1岁马头山羊作为试验对 象，利用纤维蛋白酶消化法建立马头山羊耳部组织成纤维细胞系，并分析、比较成纤维细胞不同天数生长形 态、生长曲线和冻存前后存活率等生物学特征，为体细 胞克隆、基因编辑技术种马头山羊成纤维细胞系的建立 提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养基及主要试剂

　　DMEM培养基采购自Gib co公司，胰蛋白酶消化 液采购自Amresco公司， 10%胎牛血清( FBS )采购自 Hyclone公司，二甲基亚砜(DMSO)和PBS缓冲液采购 自Sigma公司; 细胞培养皿、培养瓶、离心管均采购自 康宁公司。

　　1.2 耳组织成纤维细胞系的建立

　　1.2.1 原代细胞培养

　　保定马头山羊，用刀片刮去羊耳部待取样部分羊 毛，用碘伏和75%酒精对羊耳进行消毒，取耳缘组织约 1 cm 2 ，装入装有PBS (含80% PBS ，20%双抗)的 50 mL离心管中。在超净工作台内用手术镊将雄性马头 山羊( M1 )和雌性马头山羊( F1 )耳组织先用含5%双 抗的PBS缓冲液充分清洗，再置于一次性培养皿中充分 剪碎后放入一次性细胞培养瓶中，在培养瓶中加入5 mL 胶原蛋白酶溶液后置于细胞培养箱中消化培养3 h。充分 消化培养后离心，收集细胞放入新的细胞培养瓶中，再 加入培养液15 mL轻轻晃动使组织碎片均匀分布于细胞 培养瓶底部，将培养瓶平放置于细胞培养箱中培养，瓶 盖不能拧紧，以便细胞培养瓶内外气体交换，每隔2 d换 1次培养液，此为原代细胞系。

　　1.2.2 细胞传代培养

　　将细胞培养瓶置于显微镜下观察，细胞增殖至80% 时记录成纤维细胞贴壁和生长情况，并立刻进行传代培 养。用移液枪弃去原培养液，用PBS缓冲液清洗贴壁细 胞， 加入胰蛋白酶消化1 min， 再加入DMEM培养液后 用移液器反复吹打细胞使其从培养瓶壁上脱落，收集 培养液、离心， 弃去上清液; 用含89% DMEM 、 10% FBS 、1%双抗的培养液重新使细胞重悬， 1瓶细胞分装 到3个细胞培养瓶中传代培养，每隔2 d换1次培养液，此 为二代细胞系。

　　1.3 细胞冻存与复苏

　　1.3.1 细胞冻存

　　按照细胞传代培养的方法消化收集细胞，用冻存液 重悬后以0.5 mL/管(细胞密度为1 × 106个/ mL)分装于 冻存管中。将冻存管放入专用细胞冷冻盒，采用逐步降 温的冻存程序对细胞进行冻存，首先置于4 ℃冰箱中 2 h，再移至-20 ℃冰箱保存6 h，再移至-80 ℃冰箱保存12 h ，最后将冻存管移入气相液氮罐中长期保存。

　　1.3.2 细胞复苏

　　将冻存管从气相液氮罐中取出置于37 ℃恒温水浴锅中轻微晃动使其尽快融化。将融化后的细胞悬液移至离 心管离心后收集细胞，用15 mL同样的培养液混悬后置 于培养瓶中，放入培养箱内培养。

　　1.4 细胞生物学特性分析

　　细胞生长曲线，采用传统细胞计数法[1] 。细胞活力 测定，采用台盼蓝染色法[1]。

　　2 结果与分析

　　2.1 形态学观察

　　原代细胞培养24 h后可观察到组织块周围开始有圆 形细胞贴壁并逐渐变成梭形; 48 h后，可观察到组织块 周围有许多细胞长出，细胞形态呈细长的梭形;细胞 培养7 d后细胞汇合度达到约80%，见图1.细胞经胰蛋 白酶消化后在显微镜下为圆形点状，漂浮在细胞培养 液中[1]。

　　2.2 细胞生长曲线

　　雄性马头山羊和雌性马头山羊耳组织成纤维细胞生 长曲线均呈现“S”型，细胞生长经历潜伏期、指数增 生期和停滞期。细胞经过在培养液中呈悬浮状态的悬浮 期，悬浮期结束，细胞逐渐贴壁，细胞贴壁后还需经过 一个潜伏阶段，才进入指数增生期，大约需要细胞培养 后24 h。指数增生期是细胞培养后1 ～ 7 d，成纤维细胞 活力强，增殖速度呈现指数增长，其倍增时间约为 24 h。细胞培养4 d起，细胞数量增加迅速，培养基营 养消耗快而代谢产物积累快，生长速度减慢，进入停滞 期，见图2.

　　2.3 冻存前和复苏后细胞活性

　　雄性马头山羊和雌性马头山羊耳组织成纤维细胞冻 存前的存活率分别是96.8%和97.2%，复苏后的存活率分 别为96.0%和96.5%，经过分析， M1和F1成纤维细胞冻 存前和复苏后存活率差异不显著(P>0.05 )，M1和F1 成纤维细胞冻存前比较差异也不显著(P>0.05)， M1和 F1成纤维细胞复苏后比较也无显著差异(P>0.05 )， 见表1.

　　3 讨论

　　成纤维细胞是皮下组织的主要细胞，体外培养能 迅速增长繁殖[2] ，原代细胞分离培养主要有消化培养法 和组织块培养法[3] ，前者利用胶原蛋白酶将间质消化分 解，便于单个细胞分离生长，细胞生长潜伏期大大缩 短， 一般培养2 ～ 3 d就可以看到组织块周边有贴壁细胞 生长，是一种比较高效的细胞培养方法;后者细胞生长 速度较慢，贴壁后一般5 ～ 17 d才有细胞长出[4] 。防止微 生物污染对细胞系的建立至关重要，耳尖皮肤覆有被 毛，毛梢和毛根部位通常寄居大量微生物，要用新刀片 将被毛彻底刮净[5]。

　　本研究成功获得性别不同的1岁马头山羊耳组织成 纤维细胞系，并对其进行了生物学特性研究，发现该细 胞系具备成纤维细胞的典型形态特征和生长特性。在形 态方面，雄性马头山羊和雌性马头山羊细胞系并无差别;在生长特性方面，马头山羊雌雄个体的细胞系同样 具有潜伏期、指数增生期和停滞期，接种相同密度的细 胞时，二者生长曲线基本重合，差异不明显。

　　4 小结

　　细胞的冻存和复苏是保存畜禽遗传资源的重点，本 试验采用逐步降温的方法对细胞系进行冻存，有效避免 了细胞在冻存过程中因为突然遇冷发生“冷应激”而死 亡;细胞冻存液中含有10%的DMSO可以防止冻存管中 液体在冷冻情况下结出尖锐的冰晶而破坏细胞。本试验 细胞在冻存时采用气相液氮罐，相比于普通液氮罐，细 胞冻存管处于液氮罐的气相中，不易有液氮进入管中; 细胞在复苏时通常会放入37 ℃的水浴锅中缓慢复苏，因 冻存管中存在液氮，容易发生爆炸。如上试验优化均可 为细胞系的建立和保存提供参考。

　　参考文献

　　[1] 奎华， 王文，卿玉波，等 .不同年龄二狼山绒山羊耳组织成 纤维细胞的生物学特性[J] .养殖与饲料， 2018(4 )：5 .

　　[2] 余敏洁，杨钰楚，陈轩宇，等 . 四川省3个地方品种牛成纤 维细胞系的建立及细胞遗传特性分析[J] . 中国畜牧杂志， 2021 ，57( 12 )：96-102 .

　　[3] 关伟军，马月辉，丁鸿，等 . 小尾寒羊耳组织成纤维细胞 系的建立与生物学特性研究[J] . 畜牧兽医学报， 2005 ，36( 5 )：511-516 .

　　[4] 张宏丽，葛雷，吴彩凤，等 . 梅山猪耳成纤维细胞系的建 立及生物学特性分析[J] .上海农业学报， 2020 ，36( 1 )：82-87 .

　　[5] 乔自林，冯玉萍，李明生，等 .兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立[J] .黑龙江农业科学， 2012( 10 )：64-68 .