摘要： 副猪格拉菌是猪的一种重要病原菌， 给世界养猪业带来较大的危害和经济损失。开展副猪格拉菌的分离鉴定及特性 分析研究工作，有助于为临床诊断治疗及预防提供依据。该试验对临床发病的仔猪病料进行细菌分离培养鉴定，采用革兰 氏染色、生化鉴定、 PCR扩增、测序比对、遗传进化分析、基因分型等方法对分离菌株进行鉴定分析，同时对其进行药敏 试验及致病性研究。结果显示，分离得到副猪格拉菌， 同源性分析结果显示该菌株与副猪格拉菌不同参考菌株之间的相似 性介于92.3% ～ 95.6%，基因分型显示分离株为基因型5型。分离菌株对多西环素、阿莫西林敏感，对新霉素、泰乐菌素、 复方新诺明和头孢噻吩耐药。小鼠致病性试验显示其具有致病性。本试验相关结果为副猪格拉菌临床防控及治疗提供理论依据。

　　关键词： 副猪格拉菌,分离,鉴定,药敏试验,致病性

　　0 引言

　　副猪格拉菌(Glaesserellaparasuis ，Gps)，原名副 猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis ，Hps )，是猪上呼 吸道中的一种共栖菌，常定植在猪的鼻腔、扁桃体和气 管前段，在免疫力降低及应激条件下引起副猪格拉菌病，又称猪格拉瑟病[1] 。副猪格拉菌的血清型很多，根 据目前的血清分型方法可分为15种血清型[2] 。在我国， 通常认为血清4 、5 、12 、13和15型为优势血清型。不同 地区流行的血清型不一，且不同血清型之间缺少良好的 交叉保护[3] 。不同地区分离的菌株的耐药性及毒力往往存在差异，增加了副猪格拉菌病治疗与预防的难度。因 此，及时准确了解引起仔猪的发病病原的种类、耐药种 类及致病性，为科学准确的预防及治疗提供依据显得格 外重要。本试验采集某养殖场发病仔猪病料，进行细菌 分离鉴定，并对分离菌株进行药敏试验、进化分析及致病 性研究，以期为副猪格拉菌的治疗及预防提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 病料来源

　　山东某规模化猪场临床疑似副猪格拉菌发病仔猪， 采集肺脏、脾脏、心包液等组织器官，进行细菌分离培养。

　　1.2 主要试剂

　　TSA 、TSB培养基购自美国BD公司;无菌脱纤维 绵羊血购自南京森贝伽生物科技有限公司; DNA Maker (DL2000 )、2 ×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式 金生物公司;细菌DNA提取试剂盒购自天生生物公司; 革兰氏染色液购自青岛海博生物技术有限公司;新生牛 血清购自金源康生物工程有限公司;药敏片购自杭州滨 和生物有限公司;引物及测序工作由生工生物工程(上 海)股份有限公司合成。

　　1.3 主要仪器

　　二氧化碳恒温培养箱购自赛默飞世尔科技公司;高 压灭菌器购自上海博讯实业公司; PCR扩增仪购自朗基 生物;凝胶成像仪购自伯乐生命医学产品(上海) 有限 公司;普通光学生物显微镜购自江苏舜宇生物公司。

　　1.4 细菌分离

　　无菌采集发病猪肺脏组织，用接种环分别三区划线 接种到TSA(含10%新生牛血清和0.002% NAD)培养基 上，37 ℃, 5%二氧化碳培养箱中培养24 h后，观察菌落形态，挑取单菌落纯化培养。对纯化培养的菌落进行革 兰氏染色观察。

　　1.5 卫星试验及生化鉴定

　　将金黄色葡萄球菌在5%脱纤绵羊血平板中间做直线 划线，同时挑取纯化单菌落垂直金黄色葡萄球菌划线接 种， 37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中培养24 h后，观察靠近 金黄色葡萄球菌菌落生长良好，远离金黄色葡萄球菌无 菌落生长。同时对分离菌株进行生化鉴定。

　　1.6 细菌16S rRNA比对、同源性分析及进化树构建

　　用细菌16S rRNA通用引物[4] (见表1 )扩增分离菌 株16s rRNA基因序列，引物由上海生工生物工程有限公 司合成。 PCR体系25 μL ，反应条件： 94 ℃ 预变性 5 min;94 ℃ 1 min ，52 ℃ 30 s ，72 ℃ 1 min ，32个循 环; 72 ℃ 延伸10 min。结束后，取5 μL扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测。扩增产物送上海生工生物 工程有限公司测序。测序结果在NCBI上进行比对。同 时用MegAlign软件，参照文献[5]对分离的菌株进行PCR 扩增， 16S rRNA序列与GenBank上公布的不同血清型菌 株16S rRNA序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。

　　1.7 血清型鉴定

　　根据Howell K J等[5]报道提供4型及5型引物进行血 清型分型检测，引物序列见表2 。PCR反应条件如1.6部 分，产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

　　1.8 药敏试验

　　用接种环挑取单个菌落采取密集划线的方法接种于 TSA培养基(含10%新生牛血清和0.002% NAD)。选取 多西环素、阿莫西林、氟苯尼考、新霉素、泰乐菌素、 复方新诺明、头孢噻吩等，用K-B纸片琼脂扩散法[6]进 行药敏试验，于37 ℃、 5%二氧化碳培养箱中培养24 h 后，根据抑菌圈直径判定菌株对所选药物的敏感程度。

　　1.9 致病性试验

　　将40只KM小鼠分为4组，每组10只，攻毒菌液分别 为3.0 × 109 、2.0 × 109 、1.0 × 109 CFU/只进行腹腔注射攻毒， 0.2 mL/只，同时设置PBS对照组。连续观察7 d，记 录每组小鼠的死亡情况。

　　2 试验结果

　　2.1 病猪剖检结果

　　对发病仔猪进行剖检，可见腹腔纤维素性渗出并且 与腹腔黏连，肝脏及脾脏纤维素膜包被，腹腔积水，见 图1.

　　2.2 分离培养观察结果

　　分离得到疑似菌落，经纯化培养，在TSA平板(含 10%新生牛血清和0.002% NAD)上形成针尖大小、圆润光滑、半透明的菌落。革兰氏染色镜检观察到革兰氏阴 性、短杆状、球状等多形态菌体，见图2、图3.

　　2.3 生化鉴定及卫星试验结果

　　生化鉴定显示该分离株不溶血;脲酶试验、氧化酶 试验、吼哚试验均阴性，并且接触酶、葡萄糖、麦芽 糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还原均阳性， 符合副猪格拉菌生化特性;卫星试验观察可知靠近金黄 色葡萄球菌菌落较大，远离金黄色葡萄球菌菌落较小， 甚至无菌生长，见图4.

　　2.4 细菌16S rRNA比对、同源性分析及进化树构建

　　使用16S rRNA引物， 扩增产物电泳观察到预期条 带1 465 bp，见图5.测序结果运用MegAlign软件分析， 运用Clustal V算法将序列与GeneBank中的参序列进行比 对，并绘制和分析遗传进化树。结果表明，所测得的菌 株序列与参考序列的同源性为92.3% ～ 95.6%，见图6 。 该分离株与2株血清5型菌株构成1个分支，见图7.

　　2.5 血清型PCR鉴定结果

　　运用分型引物进行PCR鉴定，扩增产物经电泳后观 察到450 bp条带(见图8 )，与血清5型菌株条带一致， 说明分离得到5型菌株，与16S rRNA分析结果一致。鉴 定结果与我国副猪格拉菌流行血清型一致[7]。

　　2.6 药敏试验结果

　　分离菌株药敏结果显示，该菌株对多西环素、阿莫 西林敏感，对新霉素、泰乐菌素、复方新诺明、头孢噻 吩耐药，见表3.

　　2.7致病性试验结果

　　小鼠致病性试验结果显示，小鼠攻毒后均出现食欲减退、炸毛等不良症状。其中，该菌最小致死剂量在2.0 x 10°CFU/只:对照组小鼠健康存活，见表4.将死亡的小鼠剖检后进行细菌分离鉴定鉴定，证明为5型副猪格拉菌，说明该前具有致病性.

　　3 讨论和结论

　　副猪格拉菌是仔猪呼吸道常在菌，是导致副猪格拉菌病的病原体，主要引起猪的脑膜脑炎、多浆液炎、多关节炎和肺炎的各种组合为特征的全体性疾病".Sun Q等[对我国2017-2021年引起猪呼吸道疾病的病原学调查与分析结果表明。引起猪的呼吸道疾病的主要细菌病原菌之一为副猪格拉菌，且经常与猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸道病毒等免疫抑制病混合感染，给疾病预防及治疗增加困难，根据副猪格拉菌现有血清分型方法可分为15种血清型，不同地区血清型流行不同，北美地区主要为1、4.5、13、7型:荷兰地区1、2、4、5、13型:巴西地区主要为4、5、14、13、2型“1:根据相关研究，在我国的主要流行血清型为4、5、12、13型“11.本研究从发病仔猪中分离到1株疑似菌株，通过测序对序列进行同源性及进化分析确定分离到1株5型副猪格拉菌，与相关研究结果一致，说明目前流行的血清型仍主要为4型及5型相关血清型。

　　不同菌株对抗生素的敏感性不同。本研究对分离菌株进行药敏试验及致病性试验研究。药敏试验显示，该分离株对多西环素、阿莫西林敏感，对新霉素、泰乐菌 素、复方新诺明、头孢噻吩耐药。而徐引弟等[12]研究， 副猪格拉菌对头孢噻吩敏感。提示临床用药需要根据实 验室相关结果选择敏感药物，防止耐药菌株的不断出 现。本研究对该菌株进行小鼠致病性试验，试验结果表明 该菌株具有致病性，可对其进行进一步免疫原性研究。

　　参考文献

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