摘要：该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板，通过PCR扩增获得目的基因xynB ，将xynB与表达载体PET28a连接，获得重 组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21( DE3 )进行诱导表达，镍离子层析柱纯化后检测其酶学性 质。生物信息学分析表明， XynB理论大小为47 kDa，预测等电点为4.49.不含信号肽，含有1个糖苷水解酶11家族结构域 和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明， 该酶的最适pH值为5.0 ，最适反应温度为40 ℃, 金属离子Mg2+ 、 Na+ 、K+和Ba2+对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知，黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族，最适pH值为 5.0.最适温度为40 ℃,酶比活力为62.94 U/mg。

　　关键词： 黄色瘤胃球菌,木聚糖酶,xynB,异源表达,酶学性质

　　0 引言

　　植物源木质纤维素是自然界中大量存在的可再生资源，其主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。由于木植物源木质纤维素是自然界中大量存在的可再生资 质纤维素3种成分之间紧密连接，使得木质纤维素难以被降解，因此如何高效利用木质纤维素一直是研究的热 点问题。瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知 的、降解转化木质纤维素效率最高的天然体系。其中， 瘤胃内纤维降解菌及其产生的纤维素酶与半纤维素酶在 木质纤维素降解方面发挥着重要作用[1] 。黄色瘤胃球菌 是瘤胃中最主要的纤维降解菌之一，具有高效的纤维降 解能力[2] 。先前研究发现，黄色瘤胃球菌可以编码产生 多种纤维素酶、半纤维素酶和多功能酶类，这些酶类通 过高度的协同作用能够降解棉花、滤纸等纤维原料[3-4] ， 是重要的木质纤维素降解酶来源之一。

　　木聚糖酶属于糖苷水解酶，主要用于半纤维素木聚 糖主链的降解，其在饲料业、食品工业、造纸行业和纺 织行业均具有广泛的应用前景。目前，已经探明有超过 300多种生物可以产生木聚糖酶，这些酶类在作用底物 范围、最适pH值、最适温度、稳定性等方面均有其独特 性，并具有一定的潜在应用价值[5] 。黄色瘤胃球菌拥有 较为丰富的木聚糖酶基因资源，其中黄色瘤胃球菌FD-1 基因组中含有12个编码木聚糖酶的基因[6] ，黄色瘤胃球 菌17含有至少4个编码木聚糖酶的基因[7]。

　　为进一步拓展木聚糖酶资源，了解黄色瘤胃球菌半 纤维素酶系特性，本研究拟对黄色瘤胃球菌中的木聚糖 酶基因xynB进行生物信息学分析，并将其在大肠杆菌 BL21中进行异源表达与酶学性质研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株与质粒

　　黄色瘤胃球菌为本实验室先前保存菌株，载体 PET28a、大肠杆菌DH5α和BL21( DE3 )均购自北纳创 联生物技术有限公司。

　　1.2 基因序列分析与重组载体构建

　　利用在线分析网站RA ST( https: / / ra st . n mpdr . org/ )进行全基因组注释，根据注释结果选取木聚糖 酶基因xynB作为异源表达对象。利用Expasy( https:// web.expasy.org/)预测木聚糖酶XynB的等电点以及蛋 白理论分子质量。利用SignalP 4.1 ( https://services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析XynB的 信号肽编码序列。利用NetOGlyc-4.0( https://services. healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/)预测XynB 的O-糖基化位点。利用NetNGlyc-1.0( https://services. healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)预测XynB 的N-糖基化位点。利用Group-based prediction system ( https://gps.biocuckoo.cn/ )预测XynB的磷酸化位点。 利用PSIPRED( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred )预测 XynB的蛋白二级结构。利用SWISS-MODEL( https:// swissmodel.expasy.org/)预测XynB的蛋白三级结构。 以黄色瘤胃球菌基因组为模板，用引物对( xy n BF:CGGAATTCATGAGAAAAGGCATATTCAAGAAA和xynBR: CCGCGGCCGCGCCTGCTTCCTTTTCGGCAGC- TAC)进行扩增获得基因片段xynB。对基因片段xynB和 载体PET28a分别进行双酶切(EcoRI与NotI)，将酶切 后的产物进行连接转化，获得重组载体PET28a-xynB。

　　1.3 木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

　　将1 L诱导后的大肠杆菌菌液离心，收集菌体， 将 菌体沉淀重悬于50 mL预冷Tris-NaCl缓冲液中，用超声 波破碎菌体。超声破碎条件：振幅50%，工作2 s，间隔 4 s，工作总时间为15 min。将破碎后的菌体12 000 r/min 离心30 min， 收集上清。将上清液过0.22 μm 水系微孔滤 膜，用镍离子预装层析柱(HisTrap HP ，GE公司)进行 纯化。将收集的洗脱液透析过夜，获得纯化酶液，并用 Nanodrop 2000进行蛋白浓度测定。吸取上清液与纯化酶 液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE检测。

　　1.4 木聚糖酶酶学性质分析

　　1.4.1 木聚糖酶XynB最适pH值及pH值稳定性

　　将纯化后的木聚糖酶XynB与不同pH值的缓冲液 (pH值 3.0 ～ 5.0的0.2 mol/L 醋酸—醋酸钠缓冲液， pH值6.0 ～ 8.0的0.2 mol/L 磷酸氢二钠—磷酸二氢钠 缓冲液， pH值 9.0的0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液 ，pH值 10.0～ 11.0的NaHCO3-NaOH缓冲液)稀释后，与1%的 桦木木聚糖底物溶液混合， 在40 ℃条件下反应30 min ， 反应结束后，以DNS法检测还原糖的产量。酶活性单位 定义为每分钟催化产生1 µmol还原糖的酶量。将酶活性 最高值设为100%，以相对酶活力来判断木聚糖酶XynB 最适pH值。木聚糖酶XynB的pH值稳定性检测方法为将 纯化后的酶液分别置于不同pH值的缓冲液中， 在40 ℃ 条件下温育60 min，取出酶液，测定其剩余木聚糖酶活 力。其中，未处理酶液酶活设为100%，以相对酶活力 判定木聚糖酶XynB的pH值稳定性。

　　1.4.2 木聚糖酶XynB最适温度与温度稳定性

　　将纯化后的木聚糖酶XynB在30～ 60 ℃条件下(温 度间隔为5 ℃ )于pH值6.0缓冲液中反应30 min，将酶 活性最高值设为100%，以相对酶活力来判断木聚糖酶 XynB最适反应温度。木聚糖酶XynB的温度稳定性检测 方法：将纯化后的酶液分别置于20 ～90 ℃ (温度间隔为 10 ℃ ) 条件下温育60 min， 取出酶液， 测定其剩余木聚 糖酶活力。其中未处理酶液酶活设为100%，以相对酶 活力判定木聚糖酶XynB的温度稳定性。

　　1.4.3 木聚糖酶XynB底物特异性

　　将纯化后的木聚糖酶XynB，分别以CMC-Na、滤 纸、对硝基苯 - β -D-木糖苷、对硝基苯 - β -D-葡萄糖 苷、对硝基苯- β-D-半乳糖苷、对硝基苯-α-D-甘露糖 苷、对硝基苯-α-L-岩藻糖苷、对硝基苯-α-L-阿拉伯糖苷为底物，测定木聚糖酶XynB酶活性。其中，以桦木 木聚糖为底物测出的酶活力定义为100%。

　　1.4.4 金属离子对木聚糖酶XynB的影响

　　在木聚糖酶反应体系中分别加入金属离子溶液 ( CaCl2 、MgCl2 、MnCl2 、ZnCl2 、FeCl 3 、CuSO4 、 BaCl2 、NiCl2 、CoCl2 、KCl 、NaCl 、EDTA)，使其终 浓度为1 mmol/L和10 mmol/L，最适温度下孵育60 min 后，测定酶活力。其中，不加金属离子的反应体系为对 照，其酶活力设为100%。

　　2 结果

　　2.1 木聚糖酶XynB的生物信息学分析

　　木聚糖酶XynB( Sequence ID: WP_082316660.1 )共由425个氨基酸组成，预测等电点为4.49.不含信 号肽，蛋白理论大小为47 kDa。使用NCBI Conserved Domains 分析发现， XynB含有一个糖苷水解酶11家族 结构域(氨基酸残基48-236)和一个碳水化合物结合结 构域( Carbohydrate-binding modules ，CBM，氨基酸残 基276-409 )。 SIPRED分析结果显示，该蛋白二级结果 中，α-螺旋占比最少， 为8.94%(粉色)，β-折叠占比 为39.06% (黄色)，无规则卷曲占比为52% (灰色)， 见图1 。SWISS-MODEL预测的XynB三维结构由3个α - 螺旋(红色)和26个β-折叠(蓝色)组成，见图2.其 中， N段α-螺旋位于蛋白主体结构外侧，另外2段α-螺 旋则位于蛋白主体中间凹陷处。

　　2.2 木聚糖酶XynB的诱导表达与纯化

　　将含有重组质粒的大肠杆菌BL21进行诱导，收集 菌体后破碎，获得粗酶液。将粗酶液过滤，经镍柱纯化 后，透析获得木聚糖酶XynB纯蛋白。经SDS-PAGE电 泳发现，粗酶液与纯化后酶液在70 kDa大小处有蛋白条 带，其条带大小比理论值( 47 kDa) 偏大， 见图3.糖 基化修饰预测结果表明，蛋白序列在第269 、271 、275 位苏氨酸( Thr)和272位丝氨酸( Ser)，存在O-糖基 化位点，在42位和101位天冬酰胺(Asn)存在N-糖基化 位点。磷酸化修饰预测结果表明， XynB存在35个潜在的 磷酸化位点( 8个丝氨酸位点， 11个苏氨酸位点和16个 酪氨酸位点)。这些潜在糖基化和磷酸化位点的存在， 可能导致木聚糖酶XynB理论大小与实际大小间的差异。

　　2.3 木聚糖酶XynB酶学性质分析

　　2.3.1 木聚糖酶XynB最适pH值及pH值稳定性

　　首先，测定木聚糖酶XynB在不同pH值条件下的酶 活力变化，并绘制变化曲线，见图4A。结果表明，木 聚糖酶XynB的最适反应pH值为5.0.并在pH值6.0～ 8.0 的条件下有较好的酶活性( >80%)。图4B展示了木聚 糖酶XynB在不同pH值条件下的稳定性，当pH值<5.0 或pH值>8.0时，残余酶活力均降至20%以下; 在pH值 5.0～ 8.0弱酸或弱碱条件下， 木聚糖酶XynB仍保持80% 以上的酶活力。

　　2.3.2 木聚糖酶XynB最适温度及温度稳定性

　　如图5A所示，在30～ 60 ℃条件下，木聚糖酶XynB 最适温度为40 ℃。温度稳定性方面，木聚糖酶XynB在 20 ～40 ℃条件下孵育60 min，仍可以保留80%以上的酶 活力;在50 ℃条件下可以保留61.38%的酶活力;当温 度达到60 ℃或以上时，酶活力迅速下降，剩余酶活力均 在10%以下，见图5B。

　　2.3.3 金属离子对木聚糖酶XynB的影响

　　金属离子影响试验表明，低浓度( 1 mmol/L ) 的 Mg 2+ 、 K + 和 Ba 2+ 对木聚糖酶 XynB 的激活效果比 较明显，为 116.83% ～ 124.87%，而低浓度的Cu2+ 、 Mn 2+ 、 Fe 3+ 和EDTA 则对XynB 有较明显的抑制作用 ( 2.27%～ 89.05% )。高浓度( 10 mmol/L )金属离子 对XynB酶活力影响结果表明， Mg2+ 、K+ 、Co2+ 、Na+ 、 Mn 2+ 和Ba2+对木聚糖酶XynB有较明显的激活作用， Cu2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Ca2+ 、Fe3+和EDTA则有较明显的抑制 效果，见表1.

　　2.3.4 木聚糖酶XynB底物特异性

　　底物特异性试验结果表明，除木聚糖外， XynB 对CMC-Na、滤纸、对硝基苯 - β -D-木糖苷、对硝基 苯- β-D-葡萄糖苷、对硝基苯- β-D-半乳糖苷、对硝基 苯-α-D-甘露糖苷、对硝基苯-α-L-岩藻糖苷、对硝基 苯-α-L-阿拉伯糖苷均没有酶活力。其中，以木聚糖为 底物，在最适温度与pH值条件下，木聚糖酶XynB的比活力为62.94 U/mg。

　　3 讨论

　　木聚糖酶属于糖苷水解酶( GH )家族，其大部 分成员集中于GH10和GH11家族[8-9] ，少量成员分布于 GH5 、7 、 8 、 16 、43 、52和62家族[10] 。本研究异源表 达的黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族，该酶 的理论等电点为4.49.蛋白理论大小为47 kDa，共含有 2段特殊结构域( G11家族结构域和CBM结构域)，仅 对木聚糖具有降解能力。该酶的这些特点符合GH11家 族木聚糖酶的底物特异性高、蛋白分子量较低、等电 点一般位于3.0～ 7.0.蛋白结构相对简单的特点 [11] 。此 外， SDS-PAGE电泳结果显示，木聚糖酶XynB的实际大 小( 70 kDa)比理论值( 47 kDa)偏大，这可能是由于 XynB在表达之后发生糖基化、磷酸化等修饰，导致蛋 白迁移率下降。

　　酶分子的温度与pH值特征对于其今后的应用十分 重要。在温度对酶活力影响方面， XynB的最适酶活力 为40 ℃,同时，温度耐受性试验结果表明XynB在40 ℃ 及以下时，剩余酶活力在80%以上，而当温度超过60 ℃ 时，其剩余酶活力则迅速降至10%以下。以上特征与 先前报道的低温酶的经典特征相一致[12] 。在pH值适应 性方面， XynB的最适pH值为5.0.在pH值6.0～ 8.0的区 间内，可以维持80%以上的最大酶活力。与GH11家族 多数木聚糖酶最适pH值为6.5～ 7.5相比， XynB的最适 pH值偏低，但与GH11家族中枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis )木聚糖酶MxynA[13]和Penicillium funiculosum木 聚糖酶XynC[14]相一致。在pH值稳定性方面， XynB在 pH值5.0～ 8.0的区间内，保持80%以上的酶活力，说明 该酶具有一定的耐酸、耐弱碱的能力。 XynB的酶学特 征揭示其非常适合在40 ℃ 、pH值5.0～ 8.0的环境下发挥 功能。如此的使用场景，常见于反刍动物瘤胃以及动物 消化道，以及食品行业中面制品的发酵。这些特性的研究， 对于今后该酶在饲料中以及食品加工中的应用奠定 了一定的基础。

　　金属离子的不同会影响酶活性的变化。 Yang Y等[15] 发现Penicillium chrysogenum P33来源的Xyl2的木聚糖 酶活性被K+ 、Na+激活，被Cu2+和Fe3+抑制，王蕾等[16]发 现黄色瘤胃球菌双功能酶XynD的酶活性被Co2+和Ba2+激 活，但被Fe3+ 和Mn2+抑制。本试验中，木聚糖酶XynB 的酶活性可被Mg2+ 、K+和Ba2+激活，并且高金属离子浓 度( 10 mmol)比低金属离子浓度( 1 mmol)的激活效 果更好，这些金属离子的存在可能促进了酶与底物的结 合;而Cu2+ 、Fe3+和EDTA则均有较明显的抑制效果，其 中Cu2+对XynB抑制效果最为明显(2.27%～5.56%)，这些金 属离子可能影响木聚糖酶的空间结构进而使酶活力下降。

　　4 结论

　　本试验将黄色瘤胃球菌来源的木聚糖酶基因xynB进 行异源表达并进行酶学性质研究，研究发现， XynB最 适pH值为5.0.最适反应温度为40 ℃,金属离子Mg2+ 、 Na+ 、K+和Ba2+对木聚糖酶XynB有较好的激活效果，而 Cu2+ 、Zn2+ 、Fe3+和EDTA则对XynB有较明显的抑制作 用，是一株酸性低温木聚糖酶，在饲料以及食品加工领 域有一定的应用前景。

　　参考文献

　　[1] Bule P ，Alves V D ， Israeli-Ruimy V ， et al. Assembly of Ruminococcus flavefaciens cellulosome revealed by structures of two cohesin-dockerin complexes[J]. Scientific Reports ，2017.7 ：759 .

　　[2] Dass a B ， Borov ok I ， Ruimy-Israeli V ， et al. Rumen cellulosomics ：divergent fiber-degrading strategies revealed by comparative genome-wide analysis of six ruminococcal strains[J] .PLoS One ，2014 ，9( 7 )：e99 221 .

　　[3] Krause D O ，Bunch R J ， Smith W J M ，et al. Diversity of Ruminococcus strains ：A survey of genetic polymorphisms and plant digestibility[J]. Journal Applied Microbiology ， 1999 ， 86( 3 )：487-495 .

　　[4] 刘玉承，侯先志，刘占英，等. 2 株瘤胃纤维降解细菌的分 离鉴定[J]. 微生物学杂志， 2007 ，27( 6 )： 1-4 .

　　[5] 叶世超，薛婷，何文锦，等.木聚糖酶的应用及其研究进展[J] . 中国酿造， 2013 ，32( 7 )： 8-10 .

　　[6] Berg Miller M E ，Antonopoulos D A ，Rincon M T ，et al .Diversity and strain specificity of plant cell wall degrading enzymes revealed by the draft genome of Ruminococcus flavefaciensFD-1[J]. PLoS One ，2009 ，4( 8 )：e6 650 .

　　[7] Flint H J ，Martin J ，McPherson C A ，et al. A bifunctional enzyme ， with separate xy lana s e and beta( 1 ， 3 - 1 ，4 )-glucan as e domains ， encoded by the xynD gene of Ruminococcus flavefaciens[J]. Journal of Bacteriology ， 1993.175( 10 )：2 943-2 951 .

　　[8] Hu X ， Cui Y ，Lu X ， et al. Maize WI5 encodes an endo-1 ，4-beta-xylanase required for secondary cell wall synthesis and water transport in xylem[J]. Integr Plant Biol ，2020 ， 62 ( 10 )： 1 607-1 624 .

　　[9] Monica P ， Kapoor M. Alkali-stable GH11 endo- β -1 ， 4 xylanase( XynB )from Bacillus subtilis strain CAM 21 ： application in hydrolysis of agro-industrial wastes ， fruit/ vegetable peels and weeds[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology ，2021 ，51( 5 )：475-487 .

　　[10] Kumar V ，Dangi A K ， Shukla P. Engineering Thermostable Microbial Xylanases Toward its Industrial Applications[J] . Molecular Biotechnology ，2018 ，60( 3 )：226-235 .

　　[11] Henrissat B ，Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities[J] .Biochemical journal ， 1993 ，293( Pt3 )：781-788 .

　　[12] Santiago M ，Ramfrez-Sarmiento C A ，Zamora R A ，et al . Discovery ，molecular mechanisms ，and industrial applications of cold-active enzymes [J]. Front Microbiol ，2016 ，7： 1 408 .

　　[13] Polsa N ， Suyotha W ， Suebsan S ，et al. Increasing xylanase activity of Bacillus subtilis by atmospheric pressure plasma jet for biomass hydrolysis[J]. 3 Biotech ，2020 ， 10( 1 )： 1-9 .

　　[14] Furniss C S ，Belshaw N J ，Alcocer M J ，et al. A family 11 xylanase from Penicillium funiculosum is strongly inhibited by three wheat xylanase inhibitors[J]. Biochimica et Biophysica Acta ，2002 ， 1 598( 1/2 )：24-29 .

　　[15] Yang Y ， Yang J S ， Wang R N ， et al. Cooperation of hydrolysis modes among xylanases reveals the mechanism of hemicellulose hydrolysis by Penicillium chrysogenum P33[J] .Microbial Cell Factories ，2019 ， 18( 1 )： 159 .

　　[16] 王蕾，李文菁，杨东林，等. 黄色瘤胃球菌双功能酶xynD 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征[J]. 南京农业大学学 报， 2023 ，46( 5 )：922-932 .