摘要： 为建立陇东黑山羊胸膜肺炎病原的分离与鉴定方法，选取甘肃省陇东地区40例黑山羊胸膜肺炎疑似病例作为研究对象， 通过病原菌分离培养、染色镜检等方法进行鉴定。共分离培养出6株典型的单克隆菌株，镜检可见病原菌呈球形、短杆状、长杆 状或多形状。生化试验显示，除MC4菌株的四氮唑还原试验呈阴性外，其余生化试验结果均与标准菌株PG3的结果一致。血清 凝集试验表明，病羊血清和阳性血清与抗原可发生凝集反应。分离的6株病原菌经PCR检测均可扩增出一大小为423 bp的特异 性电泳条带。本研究成功建立陇东黑山羊胸膜肺炎的分离与鉴定方法，为遏制本病的蔓延扩散和精准防控提供参考依据。

　　关键词： 黑山羊,胸膜肺炎,分离,鉴定

　　0 引言

　　陇东黑山羊是我国甘肃地区的山羊重要品种之一 ， 在当地是畜牧养殖业中的一种重要养殖动物，饲养黑山羊给陇东地区带来极高的经济效应，越来越受到广大养 殖工作者的青睐，但是随着养殖规模的不断扩大，黑山 羊相关疫病也逐渐引起了社会的关注和重视。山羊胸膜肺炎是一种由支原体引起的高度接触性传染类疾病，临 床特征主要表现为发热、咳嗽、流涕、精神萎靡、眼结 膜炎和呼吸困难，产生纤维素样病变的胸膜炎和肺炎， 严重时还可以导致妊娠母羊流产[1] 。有研究表明，本病 的发病率和死亡率近年来呈现逐年攀升的趋势，部分地 区的发病率高达60%左右，死亡率达到30%，给我国养 羊业造成了巨大的经济损失[2-3] 。通过剖检病死羊、病 原体的分离培养、镜检、生化试验、凝集试验和PCR检 测等方式，可有效鉴定山羊胸膜肺炎这一疫病[4] 。本研 究拟选择甘肃省陇东地区发生胸膜肺炎的40只黑山羊作 为研究试验对象，进行胸膜肺炎病原的分离培养和相关 鉴定，为陇东黑山羊胸膜肺炎病的有效防控提供参考依 据，也为遏制本病的蔓延扩散和降低山羊养殖户的经济 损失奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　甘肃省陇东地区发生胸膜肺炎病的黑山羊40只， 胸膜肺炎支原体山羊亚种的标准株PG3 (中国兽医药 品监察所)，支原体培养基( Hyclone公司)，血清 ( Gibco公司)， DNA marker 、Taq聚合酶、 dNTP等购 自TaKaRa公司， 氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、青霉 素等其它试剂及生化试验试剂均购自国药集团公司的分 析级。引物合成由大连宝生物工程有限公司负责完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 病原分离培养

　　无菌剖取患病黑山羊的新鲜肺组织，转移至一洁 净容器，反复剪碎后，添加6 mL培养液，震荡洗涤干 净， 1 500 r/min离心3 min，取上清液分别接种于支原体 固体培养基和液体培养液中进行培养。 37 ℃培养1周， 液体培养液根据其颜色变化情况进行选择性纯化和继续 培养， 一般观察到颜色变浅的菌株作为选择对象，固体 培养基在其形成的菌落中挑取单克隆菌落进行纯化和继 续培养。重复操作进行纯化培养4次后， 获得单克隆菌 株，添加30%甘油，保存于-20 ℃条件，备用。

　　1.2.2 染色镜检

　　选取病原分离培养的菌落，均匀涂布在载玻片上， 固定后，应用姬姆萨和革兰氏分别进行染色，放置光学 显微镜下观察其形态结构特点。

　　1.2.3 生化试验

　　按照常规生化试验方法对分离菌株和标准菌株PG3 进行葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验、山梨醇发酵试 验、尿素分解试验、精氨酸水解试验、膜斑形成试验、 美蓝还原试验、四氮唑还原试验及红细胞吸附试验，观 察其产生的生化现象。

　　1.2.4 血清凝集试验

　　选择疑似胸膜肺炎的病羊作为研究对象，静脉无菌采血5 mL，倾斜静置0.5 h， 吸取上层血清，转移至另一 洁净离心管内， -20 ℃保存， 备用。选择纯化培养后获 得的支原体作为抗原。分别吸取血清和抗原各25 μL置 于一洁净的玻璃板上，充分混匀，静置反应5 min，观察 其红细胞凝集情况。 此次分为4组试验，分别是甲组： 抗原+病羊血清，乙组：抗原+ 阳性血清，丙组：抗原+ 阴性血清，丁组：抗原+生理盐水。

　　1.2.5 PCR检测

　　依 据 丝 状 支 原 体 簇 的 保 守 序 列 1 6 S r R N A 基 因 序列 ， 设 计 PC R 扩 增 的 上 游引 物 为 M C F ： 5 ’-AAGCCGATGCCCTTACATTG-3’，下游引物为 MCR ：5 ’-GTTACTGAGCTTACCCTTCA-3’。 PCR 反应体系为10 ×PCR缓冲液2 μL，上、下游引物分别 1 μL ，rTaq聚合酶1 μL，模板(提取的DNA)2 μL，灭 菌双蒸水13 μL，共20 μL 。PCR扩增条件为95 ℃预变性 3 min;94 ℃变性45 s ，48 ℃退火35 s ，72 ℃延长50 s ， 共30个循环; 72 ℃继续延长5 min。取2 μL PCR扩增产 物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，观察电泳条带情况。

　　2 结果

　　2.1 分离培养的镜检结果

　　经过多次传代纯化培养稳定后，共获得6个典型的 单克隆菌落，分别将其命名为MC1 ～ MC6.当含有病原 菌的液体培养液经过1周后，颜色变浅。固体培养基经过 1周后，形成大量的菌落，大小不一，直径在0.2 ～ 0.8 cm ， 呈煎蛋状。革兰氏染色镜下观察不着色，呈阴性。姬姆 萨染色镜下观察可见病原菌呈球形、短杆状、长杆状或 多形状，多数菌聚集一起生长，少数菌呈现单个散在生 长现象。

　　2.2 生化试验鉴定结果

　　通过生化试验发现，在分离纯化培养的6株病原菌 中，除MC4菌株的四氮唑还原试验呈阴性外，与标准 菌株PG3有差异。其余各项生化试验结果均与标准菌株 PG3的生化试验结果一致，葡萄糖发酵试验、乳糖发酵 试验、山梨醇发酵试验、美蓝还原试验、四氮唑还原试 验、红细胞吸附试验呈阳性，尿素分解试验、精氨酸水解 试验、膜斑形成试验呈阴性，具体生化试验结果，见表1.

　　2.3 血清凝集鉴定结果

　　经血清凝集试验鉴定表明，病羊血清和阳性血清与 抗原可发生凝集反应，阴性血清和生理盐水与抗原不发 生凝集反应， 6株分离病原菌的血清学鉴定结果，见表2.

　　2.4 PCR检测结果

　　PCR扩增后， 将其扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电 泳，从电泳图谱上可见MC1 ～ MC6这6株分离菌和标 准菌株PG3均能扩增出一大小为423 bp的特异性电泳条 带，与预期设计的目标条带大小相符合，见图1.

　　3 讨论

　　山羊胸膜肺炎是由山羊支原体的山羊肺炎亚种感染 所引起的一种传染类疾病，具有高度接触性的特点，临 床症状主要波及肺部病变，严重的急性病例体温可高达 42 ℃左右，黏膜充血、发绀，鼻涕转为铁锈色的脓性 黏液，脓性眼屎分泌，腹胀和腹泻，呼吸极度不畅，目 光呆滞，肺炎症状显著，母羊还会出现流产[5] 。尸体剖 检可见胸腔大量积液，呈黄色，肺部发生严重的肝样病 变和浸润，切面呈红灰色、大理石状，肺小叶间质增生 变宽，表面较粗糙，与胸壁发生不同程度的黏连。本病 呈全年地方流行性，可以通过空气—飞沫传染，阴雨、 潮湿、寒冷的密集型饲养更容易诱发山羊胸膜肺炎的发 生，发病率高， 一旦发病极容易造成死亡，给养羊业造 成巨大的经济损失[3-6]。

　　目前，主要通过流行特点、临床特征、病羊剖检和 实验室检验等方法进行诊断，山羊胸膜肺炎病原菌的分 离培养是实验室进行正确诊断的重要环节[7] 。近年，已 有大量关于该病原菌的分离与鉴定研究报道，陶立等[8]对 150只广西黑山羊胸膜肺炎病原的分离培养与鉴定进行 研究，结果显示，经分离培养的病原菌株在显微镜下观 察可见有球状、杆状、环状等形态和大小不一，应用生 长抑制试验、 PCR检测及动物试验等诊断手段进一步证 明了该病原菌为绵羊肺炎支原体。倪莉等[9]对45份疑似病例的山羊胸膜肺炎病原菌进行分离与鉴定的研究，结 果显示，经镜检、生化试验、动物试验、 PCR检测等诊 断技术鉴定该病原菌为山羊胸膜肺炎支原体。但是，关 于甘肃省陇东地区黑山羊胸膜肺炎病原的分离与鉴定较 少见研究报道。

　　本研究主要选取甘肃省陇东地区40例黑山羊胸膜肺 炎疑似病例作为研究对象，通过病原菌分离培养、染 色镜检、生化试验、血清凝集试验和PCR检测等方法进 行鉴定，共分离培养出6株典型的单克隆菌株，镜检可 见病原菌呈球形、短杆状、长杆状或多形状，多数菌聚 集一起生长，少数菌呈现单个散在生长。生化试验结果 显示，除MC4菌株的四氮唑还原试验呈阴性外，与标 准菌株PG3有差异。其余各项生化试验结果均与标准菌 株PG3的生化试验结果一致， 葡萄糖发酵试验、乳糖发 酵试验、山梨醇发酵试验、美蓝还原试验、四氮唑还原 试验、红细胞吸附试验呈阳性，尿素分解试验、精氨酸 水解试验、膜斑形成试验呈阴性。血清凝集试验结果表 明，病羊血清和阳性血清与抗原可发生凝集反应，阴性 血清和生理盐水与抗原不发生凝集反应。分离的6株病 原菌经PCR检测均可扩增出一大小为423 bp的特异性电 泳条带。上述研究结果与目前大部分研究文献报道的结 果相一致。为建立陇东黑山羊胸膜肺炎的正确诊断方法 和精准防控提供了参考依据，也为遏制本病的蔓延扩散 和降低山羊养殖户的经济损失奠定基础。

　　参考文献

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　　[2] 李锁.羊传染性胸膜肺炎的流行病学、临床症状、诊断和防 治措施[J] .现代畜牧科技， 2020( 11 )： 138-139 .

　　[3] 王雪敏，丁勇.羊传染性胸膜肺炎的诊疗及预防[J] .养殖与 饲料， 2021 ，20( 8 )： 117-119 .

　　[4] 白国华，王强， 陈延玲.一例山羊传染性胸膜肺炎的诊断与 防治[J] .现代畜牧科技， 2021( 8 )： 109-110 .

　　[5] 刘宝俊，丁勇.羊传染性胸膜肺炎的诊疗及防治措施[J] . 中 兽医学杂志， 2021(4 )：75-76 .

　　[6] 达吾列提汗·多肯.羊传染性胸膜肺炎诊断及治疗[J] .畜牧兽 医科学(电子版)， 2020(21 )：97-98 .

　　[7] 张国华，张义双，金振华，等 .羊传染性胸膜肺炎的流行病 学、临床特点、诊断及防治[J] .今日畜牧兽医， 2022 ，38( 8 )：85-86 .

　　[8] 陶立， 李军，陈泽祥，等 .广西黑山羊胸膜肺炎病原的分离 与鉴定[J] . 中国畜牧兽医， 2011 ，38( 9 )： 167-170 .

　　[9] 倪莉， 徐强，赵俊， 等. 山羊传染性胸膜肺炎病原的分离鉴 定和生物学特性[J] . 中国兽医杂志， 2011 ，47(3 )：26-27 .