摘要：为分析黑龙江省梅花鹿源产超广谱β-内酰胺类酶(ESBLs)大肠杆菌耐药基因的分布情况，为临床抗微生物药的合 理使用提出指导意见。从黑龙江省4个养殖场中分离出130株梅花源大肠杆菌，采用K-B纸片法，结果显示对诺氟沙星、环 丙沙星、氧氟沙星的耐药率达到10%以上。采用PCR技术对ESBLs基因进行检测。结果显示，耐药基因OXA、TEM的检出 率分别为13.85%( 18/130 )、76.15%( 99/130 )，CTX-M和SHV均未检出。 4个养殖场的ESBLs基因以TEM为主。

　　关键词： 梅花鹿,ESBLs,大肠杆菌,耐药表型

　　0 引言

　　梅花鹿养殖具有非常高的经济效益[1] 。近年，随着 人们健康养生观念逐渐提高，对梅花鹿产品的需求逐渐 增加，梅花鹿养殖业迅猛发展。从梅花鹿身上得到的鹿 茸、鹿肉、鹿胎、鹿骨和鹿鞭具有独特的营养价值和经 济价值[2] 。大肠杆菌作为耐药基因的主要储存库，在耐 药基因的传播中发挥着重要作用， 一旦产生耐药性极有 可能水平传递给体内其他细菌，因此大肠杆菌常被作为 耐药菌流行病学调查的重要指示菌[3] 。所以对梅花鹿大 肠杆菌多重耐药菌株的药敏试验分析可以为养鹿场临床 用药提供指导意见。在本次试验中，采集黑龙江的4个 养殖场健康梅花鹿的新鲜粪便，从中都分离鉴定出 130 株大肠杆菌，进一步对耐药株进行产ESBLs大肠杆菌的耐药基因分析，为临床用药提供理论依据。

　　1 材料

　　1.1 菌株

　　从黑龙江省4个梅花鹿养殖场采集新鲜粪便样本， 运回实验室后进行细菌的分离培养和鉴定，最终获得 130株大肠杆菌。

　　1.2 试剂和仪器

　　10 ×Buffer 、dNTP 、rTaq 、DNA Maker等均购于宝 生物有限公司; PCR检测仪，德国Biometra公司产品; 凝胶成相分析系统，美国Alpha Imager2200公司产品。

　　2 方法

　　2.1 PCR扩增模板的制备

      将130株梅花鹿大肠杆菌接种于LB琼脂液体配培养基构成混合样本，置于37 ℃摇床180 r/min培养3 h，然 后在37 ℃恒温箱中培养12 h获得一定浓度的菌液。

　　2.1.1 PCR反应体系

　　25 μ L 反应体系配置：去离子水加入 18 μ L ， 10×Buffer加入2.5 μL ， dNTP加入2.0 μL，上游、下 游2条引物各加入0.5 μL ，rTaq加入0.25 μL，样本模板 DNA加入2 μL。130株样本均进行体系配置后， 将其摇匀后放入 PCR仪器中进行扩增。

　　2.1.2 耐药基因的检测

　　对PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法观察结果。

　　2.2 药物敏感性试验

　　参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)规定的试 验步骤和标准[4] ，采用Kirby-Bauer纸片扩散法，统计130 株梅花鹿源大肠杆菌对12种抗生素的敏感率、中介率、 耐药率。

　　试验材料包括 12种药敏纸片：β-内酰胺类的氨苄西 林( AMP )、头孢他啶( CAZ )、氨曲南(ATM )， 氨基糖苷类的庆大霉素(CN)、卡那霉素(K)、阿米 卡星(AK)，喹诺酮类的诺氟沙星(NOR)、环丙沙 星(CIP)、氧氟沙星(OFX)，四环素(TE)，氯霉 素(C)和磺胺类的复方新诺明( SXT )。

　　3 结果

　　3.1 鹿源大肠杆菌耐药表型检测结果

　　当质控菌株的抑菌环处于CLSI规定的标准范围之内 时，结果才有效，见图1 。 130株大肠杆菌中，对所有的 药物的敏感率都达到了80%以上，对于AMP 、K的中介 率达到10%，耐药率方面，对NOR 、CIP 、OFX的耐药 率达到了10%以上，其余药类的比率都在10%以下。

　　3.2 耐药基因检测结果

　　以梅花鹿源大肠杆菌的 DNA 为模板 PCR 扩增 CTM-X、SHV、OXA和TEM的基因片段，经琼脂糖凝 胶电泳， CTM-X、SHV均为无， OXA和TEM分别得到 198 、717 bp的条带，同预期相符，结果见图2、图3 。 检测到产ESBLs菌株的OXA型和TEM型，检出率分别为 13.85% 、76.15%。

　　4 讨论

　　作为条件性致病菌的大肠杆菌当动物处于气候条件 突变，饮食健康改变等情况下容易引发动物出现多种炎 症疾病[5] 。抗生素药物已然成为全球范围内治疗临床疾 病和保持动物健康和生产能力的宝贵工具[6] 。细菌耐药 性的增强、耐菌谱的增宽与抗生素的滥用有着直接的 关系，这就导致对多重高度耐药菌的抑制与杀灭变得更 困难。

　    产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌是一种在 β-内酰胺类药物的持续作用压力下变异而能够产生β - 内酰胺酶的肠杆菌科细菌，它的出现是引起大肠杆菌耐 药的主要原因之一，因为产ESBLs菌株可携带氨基糖苷 类、氟喹诺酮类等多种耐药基因。 TEM型的ESBLs产生 的酶保持着能够水解第3代头孢菌素的能力[7-8] ， 并可 在人与动物间迅速传播 [9-10] ，危害人畜共同的公共卫生安全。

　　在本次试验中，选取的基因包括TEM和OXA ，其 中携带率最高的为TEM型，共有99株，占76.15%;携 带OXA型的检出率有13.85%( 18/130 )。TEM型相较于 OXA型检出率高得多，说明TEM型为黑龙江地区梅花鹿 源产ESBLs大肠杆菌的主要流行基因型。王杰等[11] 的河 南省奶牛产ESBLs大肠杆菌的流行和耐药性分析报道中 表明， CTX-M型基因的检出率为100%，仅在1个农场的 2个分离株中含有TEM型。 Zhang Y L等[12]在川渝地区肉 牛检出的109株产ESBLs大肠杆菌中， TEM型占39.4%，OXA型占29.4%，但是菌株依旧以单CTX-M型为主， 占 比55%。杨守深等[13]在福建猪源ESBLs的TEM和OXA基 因型检出率分别为12.1% 、7.5%。说明在近五年全国范 围内， TEM型和OXA型在各种养殖动物中几乎广泛存 在，近年在国外野生鹿中有不同情况的检出结果。德国 东北部野生动物的产ESBLs的大肠杆菌调查显示所有分 离株均存在CTX-M型， 而没有检出TEM或OXA型， 野 生动物的耐药性普遍低于农场动物[14] 。在波兰的野生马 鹿中分离出TEM型，但在小鹿中尚未鉴定出引起ESBLs 耐药的基因[15]。

　　梅花鹿源大肠杆菌对12种抗生素的耐药率普遍偏 低，都在20%以下;其中，耐药率较高的抗菌药物为氨 基糖苷类药物和喹诺酮类药物，对于诺氟沙星、环丙沙 星、氧氟沙星，分别为11% 、 14% 、 10%，与产ESBLs 大肠杆菌特性相符。氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、庆 大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四环素、氯霉素、复方 新诺明的耐药率均在10%以下。其中，氨曲南、庆大霉 素的耐药率为0.说明黑龙江省梅花鹿源产ESBLs大肠 杆菌对这几类药物均处于低耐药水平。综合来看，建议 养鹿场通过药敏试验筛选敏感药物治疗患病梅花鹿，而 不是随便使用抗菌药物，导致耐药，造成更大损失[16]。

　　梅花鹿人工养殖效益十分可观，现状呈整体良好趋 势。对黑龙江地区梅花鹿源的大肠杆菌进行耐药情况检 测，掌握其多重耐药趋势，据此来制定合理的药物使 用方式对临床治疗工作进行指导，才能对耐药菌进行更 好的预防与控制[17] 。从业人员掌握科学而规范的养殖技 术，根据养殖场地面积的大小，选择合适的养殖密度， 提高环境卫生水平，是确保梅花鹿健康、安全生长，保 障养殖收益的关键。

　　参考文献

　　[1] 王茵，徐楠，王彦雨，等. 2023梅花鹿产业高质量发展大会 在我市召开[N]. 辽源日报， 2023-09-08( 001 ).

　　[2] 刘书杰，张娜，李宁. 梅花鹿养殖技术与发展前景[J]. 中国 畜禽种业， 2022 ， 18( 6 )： 129-131 .

　　[3] Angulo F J ，Heuer O E ，Hammerum A M ， et al. Human Health Hazard from Antimicrobial-Resistant Enterococci in Animals and Food[J]. Clinical Infectious Diseases ，2006 ，43( 7 )：911-916 .

　　[4] 王永亮. 吉林省部分地区动物源大肠杆菌耐药性及多重耐药 株全基因组序列分析[D]. 长春：吉林农业大学， 2023 .

　　[5] Yang H C ， Chen S ，White D G ， et al. Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China[J]. Journal of clinical microbiology ，2004 ，42( 8 )：3 483-3 489 .

　　[6] Zhao L ，Dong H Y ，Wang H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J] .Science of the Total Environment ，2010 ，408( 5 )： 1 069- 1 075 .

　　[7] Lago A ，Fuentefria R S ， Fuentefria B D. Enterobactérias produtoras de ESBL em Passo Fundo ，estado do Rio Grande do Sul ，Brasil ESBL-producing enterobacteria in Passo Fundo ， state of Rio Grande do Sul ，Brazil[J]. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical ，2010 ，43( 4 )：430-434 .

　　[8] Paterson D L ， Bonomo R A. Extended-spectrum beta - lactamases： a clinical update[J]. Clinical Microbiology Reviews ，2005 ， 18( 4 )： 657-659 .

　　[9] 孙红洋，姜子楠，沈昕，等. 2018年中国兽用抗菌药物使用 情况报告[C]//中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十五 次学术讨论会论文集， 2019 .

　　[10] Li S ，Qu Y ，Hu D ，et al. Comparison of extended spectrum β-lactamases-producing Escherichia coli with non-ESBLs- producing E. coli ：rt drug-resistance and virulence[J]. World J Emerg Med ，2012 ，3( 3 )：208-212 .

　　[11] Wang J ，Zhu X J ，Zhao Y X ，et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella and ESBL E. coli isolated from dairy cattle in Henan Province ， China[J]. Preventive veterinary medicine ，2023 ，21( 3 )：213-215 .

　　[12] Zhang Y L ，Huang F Y ，Gan L L ，et al. High prevalence of blaCTX-M and blaSHV among ESBL producing E. coli isolates from beef cattle in China's Sichuan-Chongqing Circle[J] .Scientific Reports ，2021 ， 11( 1 )： 137-140 .

　　[13] Yang S S ， Fan X ， Jiang Y ， et al. Prevalence of the oqxABdrug resistance gene in Escherichia coli of pig origin in Fujian[J]. Chinese Journal of Zoonoses ，2023 ，39( 2 )： 185- 191 .

　　[14] Homeier-Bachmann T ， Schütz A ， Sylvia D ，et al. Genomic Analysis of ESBL-Producing E. coli in Wildlife from North- Eastern Germany[J]. Antibiotics ，2022 ， 11( 2 )： 123-126 .

　　[15] Dariusz W ， Magdalena Z ，Anna L ， et al. Antimicrobial Resistance in Escherichia coli Isolated from Wild Animals in Poland[J]. Microbial drug resistance( Larchmont ，N. Y. )， 2017 ，24( 6 )： 812-816 .

　　[16] 于莹，陈立志，王红梅，等. 鹿源大肠杆菌的分离鉴定及生 物学特性[J]. 中国兽医学报， 2020 ，40( 3 )： 530-534 .

　　[17] 王宏. 牛源大肠杆菌耐药性及耐药机制研究[D]. 哈尔滨：东 北农业大学， 2012 .