摘要：文章采用基于结构的半理性设计对多杀性巴氏杆菌来源的透明质酸合成酶（PmHAS）进行改造，最终获得PmHASP153S、PmHASP153D和PmHASG312S 3个突变体，并验证了这些突变体在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中合成透明质酸（HA）的能力。结果显示，相比野生型（WT），3个突变体合成HA的产量和分子量均有显著提升，且在谷氨酸棒杆菌中的提升效果明显优于大肠杆菌。在5 L发酵罐水平上，最优重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pXMJ19-PmhasG312S的HA产量为8.2 g/L，分子量为3.8 MDa，分别是ATCC13032/pXMJ19-PmhasWT的6.8（1.2 g/L）和4.2倍（0.91 MDa），实现了HA产量与分子量的共进化。结构分析发现，G312位点位于UDP-GlcNAc转移酶催化中心的入口处，且loop 312～316区域可能以“盖子”形式调控底物进入催化中心，表明UDP-GlcNAc的催化活力可能是影响谷氨酸棒杆菌合成HA的关键。P153位点位于2个催化结构域的中间，可能与新合成的糖链在2个催化中心间的转运有关。该研究对通过蛋白质工程改造提高PmHAS催化活性具有一定指导意义。

　　关键词：谷氨酸棒杆菌；透明质酸；酶工程；透明质酸合成酶；PmHAS

　　透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由β-D-葡糖醛酸（GlcA）和β-D-N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）组成的双糖单位反复交联而成的线性无分支大分子黏多糖[1]，具有优越的保湿性和黏弹性，在化妆品、食品等领域应用广泛。谷氨酸棒杆菌是一种生物安全菌，但其体内只含有合成HA前体UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的酶，需要导入外源透明质酸合成酶（HAS）才能实现HA合成。HA产量和分子量不仅受到前体浓度的影响，也受到HAS催化活性的影响[2]。

　　研究基于半理性设计的改造策略提高多杀性巴氏杆菌来源的PmHAS的催化活性，通过筛选获得3个较好的突变体：PmHASP153S、PmHASP153D和PmHASG312S。将其分别导入大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，均能使HA产量和分子量显著提升，实现HA产量和分子量的共进化。结构分析发现，位于UDP-GlcNAc底物通道入口处的loop 312～316可能以“盖子”形式调控底物进入催化中心参与反应。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、质粒pXMJ19和pECXK99E。

　　发酵培养基：玉米粉10 g/L，无水葡萄糖30 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L，NaNO3 15 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，pH调至7。

　　1.2方法

　　构建PmHAS表达载体。选取来自多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）的透明质酸合成酶基因Pmhas（GenBanK登录号为AF036004.1～703位氨基酸）进行基因合成与载体构建，获得pXMJ19-Pmhas质粒，并转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞。

　　选取突变位点与分子对接。选取与PmHAS序列相似性为62%的来自E.coli K4的软骨素聚合酶（K4CP）作为模板（PDB登录号：2z86）进行结构建模和分子动力学模拟。

　　NNK饱和突变。以野生型pXMJ19-Pmhas质粒为模板，采用全质粒PCR方法分别对PmHAS进行NNK饱和突变，待长出转化子后完成建库。

　　构建重组谷氨酸棒杆菌。采用定点突变方法筛选相应突变体，待突变质粒构建成功后转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞中，获得相应的重组工程菌。

　　谷氨酸棒杆菌发酵罐发酵：挑取单菌落于BHI培养基中培养24 h，使OD600达到10～15，以10%接种量接种至5 L发酵罐中发酵培养；添加终浓度为0.5 mmol/L IPTG诱导，诱导温度28℃。发酵过程中将pH维持在7，控制溶氧水平在30%左右，补加50%葡萄糖使发酵液中糖浓度维持在10 g/L。定点取样测定HA产量和分子量。

　　2结果

　　2.1 PmHAS的蛋白表达

　　PmHAS的蛋白表达结果与对照菌相比，重组工程菌E.coli BL21/pXMJ19-Pmhas的胞外上清中在70～100 kDa间可观察到明显的蛋白条带。这与PmHAS的理论分子量（80.7 kDa）一致，表明PmHAS可成功在大肠杆菌宿主中表达。

　　2.2获取关键位点

　　分析MD结束后PmHAS的RMSF值，发现150～155、310～313和639～643这3个区域的RMSF值波动显著；相关位点均位于loop区，且在催化中心附近。因此，选择这3个区域中RMSF值波动最大的K152、P153、G312、E313、N642和T643位点进行饱和突变文库的构建与筛选。

　　2.3 NNK突变文库筛选

　　初筛共获得83个初筛突变体。再次用96孔板复筛，重复3个平行，共获得0325-K152-E5、0325-P153-A12、0325-P153-G2、0327-P153-A6、0327-P153-A12、0327-P153-B9、0326-E313-B1和0318-G312-E7这8个突变体。测序后发现：0325-P153-A12和0327-P153-A6突变为P153S；0318-G312-E7突变为G312S；0325-P153-G2突变为P153D；0326-E313-B1突变为E313M；其他均未发生突变。

　　采用摇瓶发酵测定产量，显示突变体PmHASP153S、PmHASP153D、PmHASG312S和PmHASE313M的HA浓度为173.5、182.5、152.2和38.9 mg/L，分别为WT（75.7 mg/L）的2.3、2.4、2和0.5倍；重均分子量为0.44、0.47、0.35和0.16 MDa，较WT（0.04 MDa）分别提高11、12、8.7和4倍。

　　2.4重组谷氨酸棒杆菌5 L罐发酵

　　重组谷氨酸棒杆菌的罐上发酵结果显示，4种工程菌在发酵开始时生长迅速，在30 h后生长减缓，并在52 h时基本不再生长，OD600达到77～98，结束发酵。其中：工程菌ATCC13032/pXMJ19-PmhasG312S的HA产量和分子量最高，为8.2 g/L和3.8 MDa，是ATCC13032/pXMJ19-PmhasWT的6.8（1.2 g/L）和4.2倍（0.91 MDa）；其次为ATCC13032/pXMJ19-PmhasP153S和ATCC13032/pXMJ19-PmhasP153D，HA产量为5.1 g/L和3.1 g/L，分别是ATCC13032/pXMJ19-PmhasWT的4.3和2.6倍，分子量为1.2 MDa和3.1 MDa，分别是ATCC13032/pXMJ19-PmhasWT的1.3和3.4倍。通过脉冲电泳测定分子量的大致范围，显示所有重组菌的HA分子量分布范围均较宽。其中，重组工程菌ATCC13032/pXMJ19-PmhasP153D发酵产生的HA分子量上限最高，远超平均分子量为2.4 MDa的HA标准品。

　　2.5机制解析

　　为解释产量或分子量提升的原因，尝试将糖基供体UDP-GlcNAc和糖基受体HA4寡糖分别对接至PmHASWT和PmHASG312S的UDP-GlcNAc催化中心（D527S528D529），进行分子动力学模拟（MD）并分析RMSF值。结果显示：与PmHASWT相比，突变体PmHASG312S在loop 312～316区域的RMSF值明显升高；在PmHASWT的底物通道入口处，loop 312～316处于类似“闭合”状态，而PmHASG312S的loop 312～316处于类似“开放”状态。该区域可能影响糖基供体和受体的进入，进而作用于HA产量和分子量。P153位点在突变前后未观察到明显区别，具体机制解释仍需进一步探索。

　　3讨论

　　HA产量和分子量间存在权衡关系——高分子量HA需要以牺牲产量为代价。因此，如何通过蛋白质工程实现HA产量和分子量的共进化是亟须解决的问题[3]。本研究通过改造获得PmHASP153S、PmHASP153D和PmHASG312S 3个突变体，相比WT，其合成的HA产量和分子量均有显著提升，且在谷氨酸棒杆菌中的提升效果明显优于大肠杆菌。在5 L发酵罐水平上，最优的重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pXMJ19-PmhasG312S的HA产量达8.2 g/L，分子量达3.8 MDa，分别是ATCC13032/pXMJ19-PmhasWT的6.8（1.2 g/L）和4.2倍（0.91 MDa），实现了HA产量与分子量的共进化。

　　MD和对接分析发现，突变后loop 312～316的RMSF值升高，说明突变后该loop的灵活性增强；突变体PmHASG312S的loop 312～316摆向口袋右侧，使底物口袋处于类似“开放”状态，可能利于底物进入催化中心，参与催化合成HA；野生型PmHASWT的loop 312～316则摆向口袋中心，使底物口袋处于类似“闭合”状态，可能不利于底物进入催化中心参与催化合成HA。基于上述分析，猜想G312/S312位点所在loop 312～316可能以底物口袋“盖子”的作用参与催化反应。这种灵活loop作为“开关”的现象，在来自小球藻病毒的HAS催化机制中也有观察到[5]。P153位点位于2个催化结构域的中间，尽管结构分析上未找到合理解释，但猜想可能与新合成糖链的转运有关。改造后的PmHAS在谷氨酸棒杆菌中合成的HA产量和分子量均达到可观水平，基本与链球菌工业规模发酵HA的产量（6～7 g/L）和分子量（3.2 MDa）水平一致。

　　4结语

　　本研究采用基于结构的半理性设计对PmHAS进行突变，并获得能在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌宿主内实现HA产量和分子量提高的突变体，同时结合结构分析提出loop 312～316可能在催化过程中起到重要作用的猜想。研究提供了一种实现HA产量和分子量共进化的方法，对于通过蛋白质工程改造提高PmHAS催化活性具有一定指导意义。

参考文献

　　［1］IACONISI G N,LUNETTI P,GALLO N,et al.Hyaluronic acid:A powerful biomolecule with wide-ranging applications—A comprehensive review［J］.International Journal of Molecular Sciences,2023,24(12):10296.

　　［2］LIU L,ZHU Y F,LI J H,et al.Microbial production of hyaluronic acid:Current state,challenges,and perspectives［J］.Microbial Cell Factories,2011,10(1):99.

　　［3］E P P,A T K,S E K,et al.The functional molecular mass of the Pasteurella hyaluronan synthase is a monomer［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA),2007,1770(2):286-290.