摘要：为探究特定益生菌菌株对肠道黏膜免疫屏障及外周血细胞因子网络的调节作用，文章以两株植物乳杆菌为研究对象，构建Caco-2/HT-29细胞共培养肠道屏障模型及THP-1巨噬细胞模型，通过检测跨上皮细胞电阻值、荧光素钠渗透率、紧密连接蛋白及黏蛋白MUC2表达，评估肠道的物理与化学屏障功能。结果显示，特定植物乳杆菌可通过强化肠道屏障功能、调控炎症因子平衡及抑制NF-κB通路发挥免疫调节作用，为益生菌在肠道炎症相关疾病中的应用提供依据。

　　关键词：特定益生菌；植物乳杆菌；肠道黏膜免疫屏障；细胞因子网络；NF-κB通路

　　肠道作为人体最大的免疫器官和微生物定植场所，其黏膜免疫屏障的完整性是维持全身免疫稳态的核心环节。益生菌作为调节肠道微生态平衡的重要手段，在修复肠道屏障、调控免疫反应方面展现出了巨大的潜力，但这种有益作用的菌株特异性极强。基于此，研究选取两株潜力植物乳杆菌菌株，探究其免疫调节效应及菌株差异，筛选高效益生菌菌株，阐明其分子机制，为肠道炎症相关疾病的微生态干预提供科学依据与实验支撑。

　　1益生菌在肠道免疫稳态调节中的作用机制

　　肠道黏膜免疫屏障是由物理屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障共同构成的精密防御体系[1]。其中，由肠上皮细胞及其之间的紧密连接蛋白构成的物理屏障，以及由杯状细胞分泌的黏蛋白构成的化学屏障，是抵御病原体入侵和抗原渗透的首道防线[2]。当防线被破坏时，肠道通透性增加，形成“肠漏”，会导致内毒素和未被完全消化的食物抗原进入体循环，触发局部及全身性的低度慢性炎症反应，使得外周血中促炎细胞因子水平升高，而抗炎细胞因子水平降低[3]。

　　益生菌作用的菌株特异性极强，如长双歧杆菌1714菌株产生的胞外多糖和吲哚乳酸被证实能选择性促进人外周血单个核细胞分泌IL-10，并抑制TLR诱导的NF-κB通路激活[4]。同样，特定植物乳杆菌菌株可通过下调名为ADAM17的蛋白酶表达，减少由其介导的跨膜型TNF-α向可溶性TNF-α的切割，从而在源头上控制关键促炎因子释放。研究期望通过体外实验，模拟肠道微环境，深入探究特定益生菌菌株对肠道黏膜屏障完整性及外周血免疫细胞因子网络的综合调节作用，并初步阐明其潜在的分子机制[5]。

　　2基于体外细胞共培养模型的系统性研究方案

　　2.1实验菌株、细胞系与主要试剂耗材

　　实验选用两株具有研究潜力的植物乳杆菌作为实验菌株，分别编号为LP-A和LP-B。为模拟商业益生菌产品，菌株将以冻干粉形式保存。在使用前，需进行复苏与活菌计数。复苏使用青岛海博生物技术有限公司的MRS肉汤培养基（货号：HB0384-1）进行，该产品为即用型培养基，每袋可配制1 L溶液，支持乳酸菌生长。活菌计数采用美正生物Premium系列乳酸菌测试片，测试片为预制型培养基系统，接种1 mL样品稀释液后，于36±1℃厌氧培养48 h，即可计数红色或蓝绿色菌落，操作简便且结果直观。

　　为构建肠道炎症模型，实验选用鼠伤寒沙门菌作为致病性刺激源，为模拟病原体感染后免疫细胞所面临的炎症环境，实验将使用来自大肠杆菌的超纯脂多糖作为刺激剂。人源细胞系采用三种商品化的人源细胞系构建体外模型：①Caco-2细胞（人结直肠腺癌细胞）。购自艾碧维生物（货号：AW-CCH056），在特定培养条件下可自发分化为具有肠上皮细胞特征的细胞单层，常用于研究肠道屏障功能；②HT-29细胞（人结直肠腺癌细胞）。购自细胞株大全（货号：HT-29），可诱导分化为杯状细胞样细胞，用于研究黏蛋白分泌；③THP-1细胞（人单核细胞白血病细胞）。购自细胞株大全（货号：THP-1），经佛波酯诱导可分化为巨噬细胞样细胞，用于模拟肠道固有层的免疫细胞反应。

　　Caco-2和HT-29细胞使用高糖DMEM培养基，THP-1细胞使用RPMI-1640培养基，均添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗溶液。主要试剂包括：诱导THP-1细胞分化的佛波酯、细胞总RNA提取试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、不同PCR检测用2×SYBR Green qPCR Master Mix、细胞因子（TNF-α,IL-1β,IL-6，IL-10）酶联免疫吸附测定试剂盒，以及一次性无菌采样袋。

　　2.2菌株复苏与细胞准备

　　取LP-A和LP-B冻干粉各10 mg，分别加入1 mL无菌MRS肉汤培养基，轻轻吹打使菌粉完全溶解，随后转入9 mL新鲜MRS肉汤中，最终定容至10 mL，于36±1℃厌氧培养18 h复苏为种子液。将种子液按1∶100转接至新鲜MRS培养基，同条件培养至对数生长期（OD600为0.6~0.8）。取菌液用无菌0.9%氯化钠溶液适当稀释后，取1 mL涂布于乳酸菌测试片，每个稀释度设3个平行样，于厌氧培养48 h后计数，将菌液调整至1×108 CFU/mL备用，同时设未接种培养基为阴性对照。

　　Caco-2与HT-29细胞按1∶1混合（总密度2×105 cells/mL），接种于Transwell小室聚碳酸酯膜（孔径0.4μm），下层加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养21 d，每2 d换液，通过检测跨上皮细胞电阻值（TEER）确认屏障完整性（TEER值稳定超过200Ω·cm2）。THP-1细胞以5×105 cells/孔接种于6孔板，加入100 ng/mL佛波酯培养48 h，倒置显微镜观察到细胞由悬浮转为贴壁生长即确认分化为巨噬细胞样细胞，更换新鲜培养基备用。

　　2.3模型干预与检测方法

　　将Caco-2/HT-29细胞模型分为4组（每组3个复孔）：①空白对照组，加无菌0.9%氯化钠溶液；②炎症模型组，加10μg/mL脂多糖+1×106 CFU/mL鼠伤寒沙门菌；③LP-A干预组，先加1×108 CFU/mL LP-A菌液孵育2 h，再加入与模型组相同的刺激物；④LP-B干预组，以LP-B菌液替代LP-A，其余同LP-A组。各组于37℃、5%CO2培养24 h，同时将分化后的THP-1细胞分为对应4组，与Transwell下层培养基共培养。

　　在培养结束后，检测步骤如下：①屏障功能，用电阻仪测定各组TEER值，计算相对电阻变化（以空白组为100%）；②黏蛋白检测，收集HT-29细胞上清，用酶联免疫吸附测定试剂盒检测MUC2含量；③基因表达，提取Caco-2和THP-1细胞总RNA，逆转录为cDNA后，采用不同PCR检测紧密连接蛋白（Claudin-3、Occludin、ZO-1）及炎症相关基因（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、NF-κB）的mRNA表达，以GAPDH为内参；④细胞因子，收集THP-1细胞上清，用酶联免疫吸附测定试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白浓度，平行检测3次取均值。数据采用SPSS 26.0分析，计量数据以“均值±标准差”表示，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法。

　　3益生菌调节肠道黏膜免疫屏障的实验结果

　　3.1益生菌对肠道屏障功能的调节作用

　　肠道屏障功能的完整性决定病原体入侵阻力，所以从物理屏障（TEER值、紧密连接蛋白）和化学屏障（黏蛋白MUC2）两方面评估益生菌的修复效果，数据如表1所示。

　　从表1来看，炎症模型组TEER值仅为空白组的38%，紧密连接蛋白mRNA表达下降69%~75%，MUC2含量降低，表明肠道屏障功能严重受损。而LP-A和LP-B干预后，各项指标均明显回升，其中LP-A在提升TEER值、促进紧密连接蛋白表达及恢复MUC2分泌方面的效果均优于LP-B，体现出了菌株优势。

　　3.2益生菌对肠道免疫及炎症通路的调控作用

　　肠道炎症的发生与免疫细胞因子失衡及NF-κB通路异常激活密切相关，本部分通过检测细胞因子水平及NF-κB表达，明确益生菌的免疫调节作用，结果如表2所示。

　　从表2来看，炎症模型组呈现典型的炎症特征：TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平大幅升高，抗炎因子IL-10降低，NF-κB mRNA表达升高4.8倍。益生菌干预后，促炎因子分泌被有效抑制，IL-10水平回升，其中LP-A组促炎因子浓度降至模型组的36%~40%，IL-10接近空白组水平，NF-κB mRNA表达水平下降62.3%，调控效果均优于LP-B组。综合来看，两株益生菌均能调节免疫平衡并抑制炎症通路，但LP-A的免疫调节活性更突出，证实了益生菌作用的菌株特异性。

　　4结语

　　研究通过体外细胞共培养模型，证实LP-A和LP-B均能通过多重机制发挥保护效应：在肠道屏障修复方面，可上调紧密连接蛋白Claudin-3、Occludin、ZO-1及黏蛋白MUC2的表达，提升TEER值并降低肠道通透性，强化物理与化学屏障功能；在免疫调节方面，能抑制NF-κB炎症通路激活，下调TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的分泌，同时促进IL-10抗炎因子表达，重构平衡的细胞因子网络。并且，LP-A在各项检测指标中均展现出了更优的调节效果，验证了益生菌作用的菌株特异性。

参考文献

　　［1］王晓娟,齐平,蒋贤森,等.基于肠道菌群探讨益生菌防治高原低氧肠道损伤的机制［J］.兰州大学学报(医学版),2025,51(5):80-89.

　　［2］张洪伟,谭美姝,冯曼,等.益生菌调控动物肠道功能的机制及应用研究进展［J/OL］.中国动物传染病学报,1-11［2026-03-17］.

　　［3］伍祥龙,姜艳,杨红文.益生菌添加剂对生猪肠道健康及料重比的改善作用［J］.猪业科学,2025,42(8):80-81.

　　［4］续丹丹,程怡瑞,黄世猛,等.生物合成纳米硒对肠道黏膜免疫功能和菌群稳态影响的研究进展［J］.食品与发酵工业,2025,51(10):368-375.

　　［5］王涛,田欣蕾,张迪,等.益生菌调节肠道黏膜免疫研究进展［J］.中国兽医学报,2022,42(12):2578-2584.