目前，可转化植物甾醇合成甾体药物中间体的微生物主要有红球菌（Rhodococcus sp.）、分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、诺卡氏菌（Nocardia sp.）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）等。例如：宋宇迪等\(^{[8]}\)筛选到一株可降解植物甾醇为 9\(\alpha\)- 羟基雄甾 - 4 - 烯 - 3，17 - 二酮（9\(\alpha\)-OH-AD）的Mycobacterium sp.LY-1。
      此外，Mycobacterium fortuitum ATCC 35855 \(^{[9]}\)和Mycobacterium sp. VKM Ac-1817D\(^{[10]}\)均能转化植物甾醇合成 9\(\alpha\)-OH-AD；分枝杆菌 NRRLB-3683 和 NRRLB-3805[11-12]均可产生 4-雄烯二酮（4-AD）等。然而，目前通过微生物制备甾药中间体的种类有限，新型甾药中间体 BA 工业生产菌株仍在发掘中。因此，筛选获得一株适于工业化应用、可将植物甾醇转化合成 BA 的菌株，对以黄体酮为主的孕激素药物新资源开发具有重大的现实意义。本文从经紫外诱变后的分枝杆菌的突变体中筛选出可高效降解植物甾醇为 BA 的菌株，并进行形态、遗传学等方面的研究，确定其生物学地位，并命名为 Mycobacterium sp.SK-

1。同时，优化其底物投料方式，提高菌体生产 BA 的浓度，通过在该菌株内对 Hsd4A1过表达，获得一株高效生产 4-AD 且不易污染的菌株。

      1   材料与方法

      1.1   材料与仪器

      1.1.1    实验所用菌株、质粒及引物

      待 筛 选 样 品 来 自 研 究 团 队 前 期 对Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 经紫外诱变所得菌株 ，由实验室保藏；过表达质粒 pMV261- Hsd4A1 由实验室前期通过基因工程手段构建[13]； 16S rDNA 序列 PCR 扩增通用引物为 27F/1492R: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/ACGGYTTACCTTTTT GCAGG，由南京金斯瑞有限公司合成；pMV261 载体通用引物为 pMV261-F/R:TACCCGTGTGTACGACC AGCACGGC/TCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGT ，由南京金斯瑞有限公司合成。

      1.1.2   主要试剂

      植物甾醇（47.5% β-谷甾醇、26.4%菜油甾醇、 17.7%豆甾醇、3.6%菜籽甾醇），纯度为 99.2%以上的BA、4-AD ，均购自湖南凯瑞新生物技术有限公司；其他化学试剂如乙酸乙酯、石油醚、吐温 80、氯化钠、葡萄糖等，均购自国药公司。

      1.1.3   培养基

      种子培养基：8 g/L 葡萄糖，15 g/L 酵母粉，5.4 g/L NaNO3，0.6 g/L（NH4）2HPO4；发酵培养基：1 g/L 葡萄糖 ，15  g/L  酵母 粉 ，5.4  g/L NaNO3，0.6  g/L（NH4） 2HPO4，3 g/L β-环糊精，500 μL Tween-80，植物甾醇乳化液（0.1 g/mL）；无机盐培养基：0.5 g/L K2HPO4 · 3H2O，2 g/L 柠檬酸，0.05 g/L 柠檬酸铁铵，0.5 g/L MgSO4 ·7H2O，3.5 g/L（NH4）2HPO4，植物甾醇乳化液（终浓度为 1 g/L）；无机盐固体培养基：在无机盐液体培养基的基础上加入 1.8%～2%琼脂粉；LB 液体培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L 氯化钠；LB-T 液体培养基：在 LB 液体培养基的基础上加入 10%的吐温 80；LB 固体培养基：在 LB 液体培养基的基础上加入 1.8%～2%琼脂粉。

      1.1.4    实验仪器

      Veriti 型 PCR 仪，购自赛默飞世尔科技公司；沃特世高效液相色谱仪；LEGEND Micro21R 型冷冻离心机，购自赛默飞世尔科技公司；SCIENTZ-2C 型基因导入仪，购自宁波新芝生物科技股份有限公司； ChemiDoc XRS 型核酸紫外检测仪，购自 Bio-Rad。

      1.2   实验方法

      1.2.1   菌株筛选

      1.2.1.1   菌株初筛

      将候选菌株接种于5 mL LB 液体培养基，置于恒温振荡培养箱（30 ℃、200 r/min）孵育 2～3d。取 1 mL菌悬液经 102 倍梯度稀释后，吸取 100 μL 稀释液均匀涂布于含 1 g/L 植物甾醇的无机盐筛选培养基平板上，30 ℃恒温培养箱内持续培养至可见明显菌落。选取典型单菌落接种至 LB 液体培养基，待培养液 OD600 达到 13～15 h，通过 LB 固体培养基连续划线纯化，重复 3 次排除杂菌干扰。将筛选表型稳定的菌株转接至含植物甾醇的无机盐培养基复筛，选取具有显著甾醇降解能力的优势菌株。

      1.2.1.2   菌株复筛

      取初筛菌株按 1%（V/V）接种量转接至 50 mL种子培养基，于 30 ℃、200 r/min 振荡培养 72 h 制成种子液。将种子液以 1%接种量接种至5 mL 发酵培养基（含 1 g/L 植物甾醇），同等培养条件下持续发酵 7 d。每天取样进行有机溶剂萃取，通过 HPLC 或TLC 法检测 BA 产量。选出具有产 BA 能力的菌株进行甘油保藏，存于-80 ℃冰箱中。

      1.2.2   菌株的鉴定

      1.2.2.1   菌株的形态观察

      将复筛菌株经 106 梯度稀释后，取 100 μL 稀释液均匀涂布于 LB 琼脂平板表面，在 30 ℃恒温培养箱中孵育24～48 h。系统记录典型菌落的直径、边缘形态（光滑/锯齿状）及色素分泌特征，完成菌株表型鉴定。使用抗酸染色法处理菌株[8]，步骤如下。

      （1）使用石炭酸复红（含苯酚的碱性染料）初染固定在玻片上的细胞。

      （2）待标本冷却后用水冲洗，使用 3%盐酸酒精（酸性酒精）处理已染色的细菌。

      （3）利用亚甲蓝或其他对比色彩的染料对脱色后的标本进行复染。

      （4）利用显微镜进行观察。

      1.2.2.2    16S rDNA 的扩增

      对目的菌株使用 27F/1492R 进行 16S rDNA 测序。PCR 反应体系为：总反应体积50 μL，取目的菌液 2 μL，引物各 2 μL，2×TaqDNA 聚合酶 25 μL，剩余体积用超纯水补齐。PCR 扩增程序：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃  1 000 bp/min，30 个循环；72 ℃ 5 min。

      1.2.2.3    16S rDNA 序列测定及同源性比较

      取 PCR 扩增产物 3 μL，采用 1%（M/V）的琼脂糖凝胶电泳，检测反应产物。将 PCR 产物送至武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序。提交测序结果至 GenBank，运用BLAST 程序与库中序列比对分析确定菌种分类，使用 MEGA 12 绘制相关菌株同源发育树。

      1.2.3   植物甾醇发酵小试

      将划线分离的目的菌株接种至 LB-T 液体培养基，以 10%的接种量在种子培养基中200 r/min、30 ℃振荡培养 2 d。将二次活化后的种子液以 10%的接种量转至含有 50 mL 发酵培养基的摇瓶中，30 ℃ , 200 r/min 持续转化 7 d。每天取样，对底物和产物的含量进行检测分析。

      1.2.4   植物甾醇的助溶剂优化

      由于植物甾醇在水中的溶解度很差（<1 mmol/L），若以粉末的形式投料，底物会漂浮在菌液表面或以结团的形式沉积在底部，严重限制甾醇分子与细胞的有效接触，降低甾醇转化率。因此，反应前需要对底物进行乳化处理。乳化过程中，一般添加以下 2种助溶剂提升乳化效率。

      （1）吐温 80：直接在发酵培养基中添加，终浓度≤5%。

      （2）环糊精：将 1 g β-环糊精溶解于 100 mL 开水中，边搅拌边加入适量底物。待基本混合均匀后，用超声破碎机进一步乳化。

      1.2.5   菌株的改造

      将构建好的过表达质粒 pMV261-Hsd4A1 按照LI 等[14]的方法电转入 SK-1 中，使用 Scientz-2C 电穿孔系统操作（电击参数：电压 2 500V，电阻 1 000 Ω ,电容25 μF）。取 100 μL 涂布于含 30 μg/mL 的卡那霉素抗性的 LB 平板上，30 ℃恒温培养。2～3 d 后平板上长出单菌落，使用载体上的通用引物进行菌落PCR，将得到的 PCR 扩增片段送至武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序。对比测序所得序列与目的序列，结果一致的对应菌株即构建成功的菌株阳性菌株 SK-1phsd4A1 。对 SK-1phsd4A1 进行植物甾醇发酵7 d，每天取样检测其产物变化。

      1.2.6   分析方法

      1.2.6.1   产物的分离提纯

      反应完毕后，取 1 mL 样品注入等体积乙酸乙酯进行萃取。连续萃取 3 次后，合并乙酸乙酯，检测产物的相对产量。

      1.2.6.2   薄层层析定性分析

      甾体化合物结构中存在共轭结构，并在 UV 254nm波长下有一个最大吸收度。然而，植物甾醇分子中C4-5 双键被还原，导致其失去共轭结构。因此，在UV 254 nm 波长下无紫外吸收，需要用含有 20%稀硫酸的乙醇溶液对展开后的层析板喷淋，并于 100 ℃下烘烤 5～10 min，直至层析板上显现出清晰的底物/产物点[15]。观察样品中底物和产物的变化量，并以标准品的迁移率和点大小作为对照。

      1.2.6.3   高效液相色谱定量分析

      用液相法可准确测定 BA 产物量。具体条件如下：检测器为 UV 检测器；具有共轭双键的甾体化合物所用的检测波长为254 nm；无共轭双键的甾体化合物的检测波长为 210 nm；色谱柱为 SunFireTM C18 （4.6 mm× 150 mm，5.0 μL，Waters）；流动相为色谱级甲醇和水（8 ∶2，V/V）；流速 1 mL/min，进样体积 20 μL；色谱柱温度30 ℃ 。将所得乙酸乙酯样品高速离心，取适量上清有机相烘干，用等体积甲醇水溶液复溶，经 0.22 μm 微滤膜过滤后上样。检测前需对底物或产物建立标准曲线，进一步计算转化产物的浓度。

      2   结果与分析

      2.1   筛选结果

      通过平板筛选，从原始菌液中分离得到 2 株以植物甾醇为唯一碳源的菌株。对发酵产物进行 TLC层析法定性并用 HPLC 进行色谱分析。TIC 薄层层析图谱显示，经稀硫酸烤板后，植物甾醇标准样品在TLC 板最上方显黑色，BA 标准品在其下方显黄色（见图 1a）。2 号菌株发酵液中检测到 BA，且植物甾醇已被大部分转化，而 1 号菌株并未观察到产物生成。由此推断，2 号菌株具有将植物甾醇转化为 BA的能力，暂命名为SK-1。此外，HPLC 色谱分析结果显示，BA 标准品的出峰时间为 15.72 min，而 2 号菌株发酵液的主产物的出峰时间与 BA 标准品一致，进一步证实该菌株能够将植物甾醇转化为 BA（见图 1b）。

      2.2   菌株细胞形态

      2～4 d 后菌株 SK-1在 LB 固体培养基上生长出菌落，且单菌落呈现淡黄色、圆形，表面光滑、不透明，边缘整齐圆润（见表 1）。菌体在种子培养基中培养时为均匀悬浊液，静置几乎不沉底部。菌株 SK-1通过抗酸染色法染色后，菌株显蓝紫色，菌体形态为细长略弯曲状，菌体较小，呈聚集状态（见图2）。分枝杆菌在抗酸法染色后呈红色或紫红色。这是因为细胞壁上的分枝菌酸能抵抗酸性酒精的脱色作用，保留初染时的石炭酸复红。而 SK-1 经抗酸法染色后呈蓝紫色，结合 SK-1 在水相中的生长状态为分散均一的状态，可合理推测 SK-1 的细胞壁可能发生改变，使脂质和分支酸发生变化，被复染剂染成蓝色。

      2.3   菌株 16 S rDNA 序列测定

      采用 PCR 技术扩增菌株 SK-1 的 16S rDNA 基因，获得全长 1.6 kb 的核苷酸序列。将测序结果提交至 NCBI GenBank 数据库进行 BLAST 同源性分析，综合形态学观察（菌落形态、染色特性）及分子系统发育分析（基于邻接法构建的系统发育树），明确SK-1 的分类地位。系统发育树中，SK-1 与分枝杆菌属模式菌株形成高支持率分支（ 自展值=99），依据《伯杰氏系统细菌学手册》命名规则，暂定分类为Mycobacterium sp. SK-1（见图 3）。

      2.4   植物甾醇助溶剂的优化

      植物甾醇在微生物中的降解需要进入细胞内部。 植物甾醇为疏水性化合物，在水中溶解度很低（<1 mmol/L）[16] ，可通过底物的投料方式进行调整，进一步提高底物转化效率。例如，在底物中添加助溶剂，增强底物与微生物间的接触，从而有效提高甾醇的转化效率。吐温 80 作为表面活性剂，既能使植物甾醇在水中更加分散，又能改变细胞通透性[17]。环糊精的环状结构提供了一个疏水的内部空腔，而自由氢基位于环外侧，使环糊精具有内疏水、外亲水的特殊性质。凭借这一特性，环糊精可以与植物甾醇形成主客体复合物，提高溶解度和稳定性[18] 。因此，本实验室在投料过程中将吐温 80 与环糊精搭配使用。一般环糊精包埋法使用 β-环糊精(β-CD），但在实操过程中，β-环糊精在常温水中水溶性过低。另一种羟丙基 β-环糊精（HP-β-CD）是 β-环糊精的醚化衍生物——羟丙基的引入打开 β-环糊精分子内的氢键，形成无定形混合物[19-21]，显著提高了水溶性。本文集中探讨上述 3 种助溶剂对 SK-1菌株转化植物甾醇的影响。

      研究系统评估了非离子表面活性剂吐温 80（浓度梯度 0.05%～0.5%）对菌株 Mycobacterium sp. SK- 1 甾醇代谢活性的调控作用（见图4）。实验数据显示，当吐温 80 添加量为 0.1%（V/V）时，植物甾醇的生物转化效率达到峰值（65.7%± 1.2%），表明该浓度可有效改善底物疏水性并促进菌体跨膜转运。值得注意的是，当浓度超过 0.1%后，底物转化率呈现显著剂量依赖性下降（P<0.05），推测高浓度吐温 80 或引发毒性效应抑制酶系活性。

      将吐温 80 浓度定为 0.1%，分别对不同浓度的β-环糊精和羟丙基 β-环糊精进行研究（见图5）。结果显示，β-环糊精在添加浓度为 1.5%时，植物甾醇转化效率最高，达 61.7 %；羟丙基 β-环糊精在浓度为 2%时，植物甾醇转化效率最高，达 84.4%。综合考虑，羟丙基 β-环糊精更适合实际运用。因此，最终确定吐温 80 的最适添加浓度为 0.1%；羟丙基 β-环糊精的最适添加浓度为2%。

      2.5   对 SK-1 进行菌种改造

      研究团队前期通过基因敲除构建了主产物为BA 的工程菌株 HGMS11。SK-1 与 HGMS11 菌种相比，具有生长速度快、菌株形态易分散，且对植物甾醇 转 化 率 高 的 优 点 。 4 - 雄 烯 二 酮 （4 - androstenedione，4-AD）作为合成甾体药物的核心前体，可合成大部分甾体激素类药物[2]。研究团队对Hsd4A 进行分析鉴定，发现将 hsd4A1 基因敲除后几乎可完全阻断 4-AD 途径的代谢通量，且在相关菌株中强化 hsd4A1后 4-AD 积累量有明显提升[13]。因此，实验尝试在 SK-1 中对hsd4A1 进行过表达，以获得生长速度快、不易污染、高效高产 4-AD 菌株。

      过表达菌株 SK-1phsd4A1 发酵产物的 TLC 检测图显示 ，经烤板后，4-AD 样品为绿色，BA 样品为黄色，且在板上位置较接近（见图6a）。因此，采用HPLC 法进一步检测验证。结果显示，过表达菌株SK-1phsd4A1  的发酵主产物的出峰时间与 4-AD 标准品出峰时间（8.5 min）一致，且产物较单一（见图6b）。在底物添加浓度为 15 g/L、温度为 30 ℃、转速为 200 r/min、转化时间为7 d 的培养条件下，4-AD浓度达 10.3 g/L。

      3   总结与展望

      本研究通过定向筛选策略，从分枝杆菌突变库中分离获得一株高效转化甾醇合成 BA 的菌株Mycobacterium sp. SK-1。该菌株经抗酸染色后呈蓝紫色，光学显微镜下呈细长微弯杆状；菌落为淡黄色、边缘光滑的凸起型。通过对 SK-1 的 16S rDNA序列与 NCBI（GenBank）对比分析，将其归于分枝杆菌属，结合生理生化特征，命名为 Mycobacterium sp. SK-1。在基础发酵体系（植物甾醇投料量 5 g/L、30 ℃、 200 r/min 振荡、7 d 转化周期）中，菌株 SK-1 的 BA产量达 3.38±0.15 g/L。为进一步提升底物利用率，构建复合传质增效体系（0.1%吐温 80 与2%羟丙基- β-环糊精联用），利用表面活性剂的增溶效应与环糊精的包合缓释作用，显著改善植物甾醇的生物可利用度，最终实现转化率突破 80%（80.2± 1.5%，P< 0.01）。该策略为疏水性甾体底物的高效微生物转化提供了可推广的工艺范式 。在 SK-1 菌株中对Hsd4A 过表达后，过表达菌株 SK-1phsd4A  的主产物为4-AD 。当植物甾醇投料为 15 g/L 时，在最佳培养条件下，4-AD 的产量达 10.3 g/L。本研究聚焦 SK-1 的甾醇代谢网络解析，后续可通过基因组尺度代谢模型（GSMM）解析 C19 甾酮合成的关键限速步骤，进一步提升菌株 SK-1生产甾体药物中间体的性能。