摘  要：金黄色葡萄球菌是食品安全领域的重要致病菌之一，其快速准确检测对保障公众健康意义重大。实验系统研究了 GB 4789.10-2016 标准方法在不同食品基质中的应用，优化了样品前处理流程和培养条件，建立了适用于乳制品、肉类产品和即食食品的检测流程。方法学验证表明，优化后的检测方法回收率达 89.4% ~ 95.2%，重复性相对标准偏差（SRSD）小于 5%，特异性达 100%，能够满足食品企业的质量控制需求。

       关键词：金黄色葡萄球菌；标准检测方法；食品基质；方法学验证；前处理优化

       食源性疾病已成为全球公共卫生重要议题，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒事件占细菌性中毒事件的 25%以上，在适宜条件下，该菌4~6 h 内即可产生致病的肠毒素量[1] 。传统平板计数法因其结果准确可靠、成本低廉，目前仍是食品企业质量控制的主要方法，然而，该方法存在操作繁琐、耗时较长等局限性，通常需要 48~72 h 才能获得结果[2]。因此，优化标准检测流程，探索控制策略，对降低食品安全风险具有重要现实意义。本研究通过实验，优化标准检测方法在不同食品基质中的应用并实施方法学验证，为食品企业提供科学依据。

       1   材料与方法

       1.1   菌株与样品

       金黄色葡萄球菌菌株 ATCC 25923 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，冻干菌种经活化复苏、纯化培养扩增后，接种于营养琼脂斜面，于 37 ℃培养后，置 4 ℃斜面短期保存或-80 ℃超低温保存备用[3]，工作菌株传代培养次数不超过 5 代，每次实验前进行纯度检验和生化特性确认。阳性对照菌液采用麦氏比浊法估算菌液浓度后，用无菌 0.9%氯化钠溶液将其浓度稀释至 108  CFU/mL。

       实验样品涵盖 3 类食品基质：乳制品包括巴氏杀菌乳及奶酪制品，肉类产品选取猪肉、禽肉，即食食品涉及糕点、凉拌菜、酱卤制品。所有样品采用无菌袋封装，冷链运输至实验室，于 2~4 h 内完成前处理，检测依据 GB 4789.10-2016 进行，每批次样品采集 3 个平行样品。

       1.2   培养基与试剂

       Baird-Parker 琼脂培养基作为选择性分离培养基，添加卵黄-亚碲酸钾乳剂增强鉴别能力，利用菌株分解卵磷脂产生卵黄反应和还原亚碲酸盐形成黑色菌落的特性实现筛选[4] 。营养肉汤用于活化和增菌培养。血浆凝固酶试剂盒，阳性结果表现为血浆在37 ℃下于 1~4 h 内使兔血浆凝固。血琼脂平板用于菌落形态特征的观察，典型金黄色葡萄球菌菌落周围可见完全透明的 β 溶血圈。

       1.3   仪器设备

       微生物实验均在生物安全柜中进行，操作环境符合 ISO 5 级洁净度要求。样品培养使用生化培养箱，温度波动度为±0.5 ℃[5] 。立式压力蒸汽灭菌器工作压力 0.14 MPa，121 ℃灭菌 20 min 确保培养基和器材无菌。高速冷冻离心机最高转速 16 000 r/min，用于样品离心分离和脂肪层去除。

       1.4   实验方法

       1.4.1   检测方法实验

       样品前处理采用无菌均质技术，称取 25 g（mL）样品加入225 mL 无菌 0.9%氯化钠溶液制备 1 ∶ 10稀释液。乳制品，将 1 ∶ 10 稀释液经离心去除上层脂肪，取下层液体进行后续操作；肉类产品，在均质前添加蛋白酶 K 消化降解蛋白干扰。检测按照 GB 4789.10-2016 标准操作，将上述样品经系列梯度稀释后 ，吸取适量样品稀释液，涂布在 3 个 Baird- Parker 琼脂平板，倒置平板，于 36± 1 ℃培养 48 h[6]。培养后，从每个平板上挑取 3 ~ 5 个典型黑色菌落（周围有卵黄反应晕圈）进行革兰氏染色镜检和血浆凝固酶试验确证。根据确证结果，计算阳性菌株数及菌落总数，比较不同食品基质的回收率。

       1.4.2   方法学验证实验

       检测限测定：将标准菌株稀释至不同浓度梯度（101~106  CFU/mL），每个浓度梯度设置 5 个平行样，按优化检测流程操作，统计阳性检出率，确定方法检测限。

       特异性验证：选取 5 种食品污染菌（大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌），接种于 Baird-Parker 琼脂平板，在相同条件下培养，观察并记录非目标菌的生长情况及其菌落形态，评估选择性培养基对目标菌的特异性分离能力。

       重复性试验：由操作者在相同条件下，对同一样品连续检测 6 次，计算 SRSD 评估方法的重复性。

       准确性验证：采用加标回收实验评估。在阴性样品中添加不同浓度（102、103、104  CFU/g）的标准菌液，根据检测值与添加值计算回收率和变异系数。

       稳定性考察：考察不同保存条件（4 ℃、-20 ℃)和保存时间（0、24、48、72 h）对样品中菌落数量的影响。

       2   结果

       2.1   标准方法在不同食品基质中的应用效果

       GB 4789.10-2016 平板计数法检测周期为48 ~ 72 h。不同食品基质对检测结果影响显著：乳制品回收率为 89.4% ~ 94.7%，离心处理后，全脂牛奶的回收率提高了 5.3% ；肉类产品回收率为 91.2% ~ 93.6%，蛋白酶 K 处理有效降低了蛋白干扰；即食食品的回收率为 85.6% ~ 92.3%，其回收率与基质复杂性（如高糖、高盐）对菌落形成及鉴定的影响有关。典型菌落在显微镜下观察为革兰氏阳性菌（直径约0.8 ~ 1.0 μm，排列呈葡萄串状）。

       在 Baird-Parker 琼脂平板上典型菌落特征为：直径 2 ~ 3 mm，黑色有光泽，周围有 2 ~ 5 mm 透明晕圈。在血琼脂平板上典型菌落特征为：菌落较大，圆形，光滑凸起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。经血浆凝固酶试验确证阳性率达95.3%，假阳性主要来自部分凝固酶阴性葡萄球菌。

       2.2   不同食品基质对检测的影响研究

       不同食品基质会对检测产生差异性干扰，需要针对性优化前处理方法。乳制品中的脂肪层覆盖平板表面，严重影响菌落观察，未经离心的全脂牛奶菌落回收率为 89.4%，经 4 000 r/min 离心 10 min 后，脂肪层被有效去除，培养基表面清晰，典型菌落回收率从 78.5%提升至94.7%。相比之下，脱脂牛奶因脂肪含量低，回收率稳定在94.7%。

       肉类产品如猪肉样品中的肌红蛋白会渗入培养基，使培养基背景色加深，严重影响黑色菌落判读和计数准确性，初始回收率为 91.2%，加入 0.1%蛋白酶 K 于 37 ℃处理30 min 后，蛋白质被有效降解，培养基背景色明显变浅，黑色菌落清晰可辨，回收率提升至 93.6%。

       即食食品基质最为复杂，糕点高糖、凉拌菜有机酸、酱卤制品香辛料等成分抑制菌株生长，回收率波动在 85.6% ~ 92.3% 。糕点类采用双倍稀释降低抑制物浓度，并延长培养时间至 72 h 以补偿生长延迟，回收率提升至 91.8%；凉拌菜经 pH 中和处理及延长培养至 72 h，回收率提升至 93.5%。即食食品的整体回收率达到 91.8% ~ 95.2%，各基质的平均回收率均高于 90%，满足检测要求。

       2.3   方法学验证结果

       检测限测定结果显示，当菌液浓度为 102 CFU/mL时，检出率达 100%；浓度降至 101  CFU/mL 时，检出率为 60% 。因此，确定方法检测限为 102  CFU/mL。

在特异性验证中，5 种非目标菌株在 Baird - Parker 琼脂平板上均未形成典型菌落，确证试验特异性达 100%。

       重复性试验结果显示同一样品 6 次重复检测的SRSD 为 3.2%，符合微生物检测方法要求。

       在加标回收实验中，低、中、高三个浓度（102、 103、104   CFU/g）标准菌液 的平均 回 收率分别 为92.4%、94.7%和 93.1%，均在可接受范围内，变异系数为 3.5% ~ 4.1%，表明方法准确度高。

       样品在4 ℃保存，菌数随保存时间延长而下降， 24 h 为 7.48 log CFU/g，48 h 后降至 7.02 log CFU/g， 72 h 降至 6.85 log CFU/g；而在-20 ℃冷冻保存 72 h，菌数从 7.50 log CFU/g 降至 7.45 log CFU/g，降幅小于 0.1 log CFU/g，表明冷冻保存更利于维持样品稳定性。

       将优化方法与商品化快速检测试剂盒进行对比，100 份样品检测结果的一致性达 96%，平板计数法虽需48 ~ 72 h，但成本仅为快速法的 1/5，结果可靠，适用于大批量常规检测。

       3   讨论与结论

       GB 4789.10-2016 标准方法具有准确可靠、成本低廉等优势，但不同食品基质存在差异性干扰。本研究通过分析，建立了不同食品类型的特异性前处理优化方案：乳制品，以 4 000 r/min 离心 10 min可有效去除脂肪层，使菌落回收率从 89.4%提升至94.7%；肉类产品添加 0.1%蛋白酶 K，于 37 ℃处理30 min，消除肌红蛋白干扰，回收率提高至 93.6%；基质复杂的即食食品，采用双倍稀释、pH 调节及延长培养时间至 72 h 等策略 ，使回收率达 91.8% ~ 95.2%。该优化方法已在多家食品企业试用，实际应用效果良好。

       方法学验证表明，优化后的检测限为 102  CFU/mL、特异性强（100%）、重复性好（SRSD  3.2%）、准确性佳（回收率 92.4% ~ 94.7%）。样品在4 ℃可保存 24 h， -20 ℃可保存 72 h。与快速检测法相比，平板计数法成本仅为其 1/5，结果可靠，更适用于食品企业大批量检测。

       本研究局限性在于，优化方法主要针对 3 大类食品基质，对特殊基质的适用性仍需进一步验证；检测周期48 ~ 72 h，对应急检测存在时效性限制。建议后续研究探索缩短检测周期的方法，并结合分子生物学技术实现快速检测与精准溯源。

       综上所述，本研究优化了 GB 4789.10-2016 标准方法在不同食品基质中的应用，建立了系统化的前处理方案和质量控制体系。优化方法成本低廉、操作简便、准确可靠，完全满足食品企业的质量控制需求，对提升食品安全监测能力具有重要实用价值。

参  考  文  献

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