摘要：针对肿瘤微环境的特异性响应需求，文章设计并合成了pH响应型铜基金属-有机框架（Cu-MOFs）材料，构建了可控NO释放体系，以系统探究其对肿瘤细胞氧化应激及凋亡的调控机制。细胞实验表明，Cu-MOFs介导的NO释放可诱导HeLa细胞内活性氧（ROS）水平呈剂量依赖性升高，使超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性先代偿性升高后显著下降，最终通过调控Bcl-2、Bax、Caspase-3线粒体凋亡通路，诱导MCF-7细胞凋亡。文章揭示了Cu-MOFs通过pH响应性NO释放触发肿瘤细胞氧化应激级联反应并诱导凋亡的新机制，为开发靶向肿瘤微环境的NO递送系统提供了理论依据。

　　关键词：Cu-MOFs介导；NO释放检测；肿瘤细胞；氧化应激

　　癌症是威胁人类健康的重大疾病。传统化疗、放疗因缺乏肿瘤特异性易产生严重副作用，亟须开发高效、低毒的靶向治疗方案[1]。一氧化氮（NO）作为内源性生物活性分子，具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成和调节免疫反应等多重抗肿瘤功效，但半衰期短（仅数秒至数分钟）、体内递送不可控等问题限制了临床应用[2]。铜基金属-有机框架（Cu-MOFs）因铜离子的配位灵活性和生物相容性，在生物医学领域展现出独特优势——其孔道内羧酸配体可响应肿瘤酸性微环境（pH 6.5～5.0），通过配位键断裂实现NO的可控释放[3]。本文以Cu-BTC（金属有机框架材料）为模型材料，构建pH响应型NO释放体系，为设计靶向肿瘤微环境的智能递送系统提供新视角。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　合成试剂：硝酸铜（Sigma-aldrich）、苯二甲酸（Alfa aesar）、咪唑（Thermo fisher scientific）。细胞培养试剂：RPMI 1640培养基（Gibco）、DMEM培养基（HyClone）、胎牛血清（Gibco）。

　　设备：Heracell 150i二氧化碳培养箱、5424R台式冷冻离心机、Eclipse Ti2-U倒置荧光显微镜。

　　细胞株：HeLa细胞（人宫颈癌）、A549细胞（人肺癌）、MCF-7细胞（人乳腺癌）。

　　1.2实验方法

　　1.2.1 Cu-MOFs材料的合成与表征

　　在合成方面，研究采用溶剂热法制备Cu-MOFs材料，利用布拉格方程进行计算，具体如下。

　　nλ=2dsinθ（1）

　　式中：n为衍射级数，是>0的整数，代表X射线在晶体中发生衍射的次数；λ为X射线的波长，是已知的固定参数；d为晶面间距，反映晶体内部原子排列特征；θ为衍射角。通过分析衍射图谱中峰位、峰强及峰形，确定材料的晶体结构和纯度。

　　1.2.2 NO释放检测

　　NO释放检测采用荧光光谱法，以DAF-FM DA（diaminofluorescein-FM diacetate，一种检测NO和活性氮RNS水平的活性染料，可用于生物成像）作为荧光探针，将Cu-MOFs与探针共孵育，利用荧光强度与NO浓度的线性关系，结合环境参数、材料浓度及孵育时间等变量，探究NO释放规律。

　　1.2.3肿瘤细胞培养与处理

　　将细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养。对数生长期时，加入不同浓度Cu-MOFs，设置空白和阳性对照组，特定时间点收集细胞。

　　1.2.4氧化应激指标检测

　　活性氧（ROS）水平检测采用DCFH-DA（可渗透细胞，用于检测细胞内活性氧的探针）检测；通过qPCR分析Nrf2、HO-1等基因转录水平，结合Western blot检测蛋白表达。

　　1.2.5细胞凋亡检测

　　凋亡细胞形态观察采用Hoechst 33342/PI双染法，利用荧光显微镜观察细胞核形态。凋亡相关基因和蛋白表达检测运用qPCR和Western blot技术，分析Bcl-2、Bax、Caspase-3等关键基因和蛋白表达变化，阐明NO释放调控细胞凋亡的分子机制。

　　2结果与分析

　　2.1 Cu-MOFs材料的表征结果

　　在2θ为7.2°,8.5°,24.6°处出现特征衍射峰，与Cu-BTC（BTC=1,3,5-苯三甲酸）的标准图谱（PDF#78-0649）完全匹配，表明材料具有典型的Cu-BTC框架结构。无杂峰出现，说明材料纯度≥98%。晶面间距（d值）显示，hkl晶面分别为111，200，321，对应金属节点与有机配体的配位方式符合理论预期，证实目标Cu-MOFs成功合成。

　　2.2 NO释放检测结果

　　通过荧光探针法检测不同pH条件下的NO释放行为。具体结果如表1所示。

　　在pH 5.0（模拟肿瘤微环境）条件下，24 h累积释放量达42.3±1.8μmol/g，显著高于pH 7.4（生理环境）的8.9±0.6μmol/g（P<0.01）。其中，在pH 5.0前6 h释放最快（占总释放量65%），因酸性条件下羧酸基团质子化导致配位键断裂，促进NO释放。

　　2.3氧化应激指标检测结果

　　2.3.1活性氧（ROS）水平升高

　　采用DCFH-DA探针检测HeLa细胞内ROS水平，发现Cu-MOFs处理组荧光强度随浓度升高呈剂量依赖性增强。当质量浓度为50μg/mL时，ROS水平达对照组的3.2倍（P<0.001），表明NO释放诱导肿瘤细胞氧化应激。进一步分析显示，ROS升高与NO介导的线粒体呼吸链损伤相关—NO与线粒体细胞色素c氧化酶结合，导致电子泄漏并生成超氧阴离子(·O2-），进而引发过氧化氢（H2O2）等次级ROS累积。

　　2.3.2抗氧化酶活性动态变化

　　SOD、CAT、GSH-Px活性检测结果显示，处理6 h酶活性短暂升高（SOD+32%，CAT+38%），可能是细胞对轻度氧化应激的代偿反应；24 h则显著下降（SOD-33%，CAT-40%），表明持续的NO释放导致氧化损伤超过细胞抗氧化能力。具体结果如表2所示。

　　Nrf2信号通路关键基因（HO-1、NQO1）的mRNA表达在处理后12 h达到峰值（上调2.5～3.0倍），后因ROS过度累积受到抑制，进一步证实氧化应激的双重调控效应—低水平NO激活抗氧化通路；高水平NO引发不可逆损伤。

　　2.4细胞凋亡检测结果

　　2.4.1凋亡率的剂量依赖性升高

　　Annexin V/PI双染法显示，MCF-7细胞凋亡率随Cu-MOFs浓度增加显著上升，如表3所示。

　　40μg/mL Cu-MOFs处理48 h，总凋亡率达45.6±3.5%，较对照组（8.2±1.0%）升高5.6倍（P<0.001）。其中，早期凋亡率28.3±2.5%，晚期凋亡率17.3±2.3%。观察凋亡形态发现，处理组细胞皱缩、核固缩及凋亡小体形成，而对照组细胞形态完整，进一步验证NO释放的促凋亡效应。

　　2.4.2凋亡信号通路激活

　　分子机制研究表明，处理组Bax蛋白表达上调2.3倍，Bcl-2蛋白下调65%，促/抗凋亡蛋白比值（Bax/Bcl-2）从0.8升至3.2，同时cleaved Caspase-3表达上调3.1倍，证实线粒体凋亡通路被激活，具体如表4所示。

　　qPCR检测显示，促凋亡基因Bax的mRNA水平升高2.8倍，抗凋亡基因BCL-2下降58%，与蛋白表达趋势一致。Western blot条带显示，处理组cleaved Caspase-3条带显著增强，而总Caspase-3水平无明显变化，表明凋亡执行酶被特异性激活。

　　3结论与讨论

　　本文明确Cu-MOFs的晶体结构及pH响应性NO释放特性：其释放的NO通过诱导ROS生成打破氧化还原平衡，长期作用致细胞不可逆损伤，并通过调控Bcl-2/Bax/cleaved Caspase-3通路诱导肿瘤细胞凋亡，且呈剂量依赖性。

　　创新点在于发现Cu-MOFs酸性响应释放特性与线粒体氧化应激的协同作用，为pH敏感型NO递送系统设计提供依据。后续可探索材料体内靶向效率及其与化疗药物联合效应，为临床转化奠定基础。

　参考文献

　　［1］陈思羽,许亚梅,米虽才,等.晚期恶性肿瘤患者血液高凝状态与炎性细胞因子的关联性研究［J］.现代肿瘤医学,2025,33(9):1501-1508.

　　［2］孙琳歌,苏皎,刘艳君,等.基于肺癌自身抗体的EGFR突变晚期肺腺癌一代EGFR-TKI靶向治疗效果的列线图预测模型构建［J］.安徽医科大学学报,2025,60(7):1325-1332.

　　［3］许文金,谢雨欣,林心悦,等.二甲双胍缓解胰腺癌细胞衰老并增敏放疗的效果及机制［J］.安徽医科大学学报,2025,60(7):1282-1290.