摘要：为探索B型肉毒复合物纯化工艺，文章选择2款相同配基阴离子交换层析介质（葡聚糖和琼脂糖）纯化B型肉毒毒素复合物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及比活性（生物学纯度）分析纯化效果，优化选定的层析方法。最终建立碱性条件下提取，琼脂糖骨架填料的柱层析纯化B型肉毒毒素复合物的工艺路线，使纯化后的B型肉毒毒素复合物的比活性均不低于1.0×107 LD50/mg。结果显示，复合物纯化工艺中选择琼脂糖骨架填料作为柱层析介质，以弱碱性磷酸为缓冲液，用1 MNaCl洗脱，分离效果较好。

　　关键词：B型肉毒复合物；纯化；SDS-PAGE；比活性

　　1材料

　　1.1试剂

　　磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、硫酸铵、柠檬酸、柠檬酸三钠、醋酸钠等，均为国药试剂；阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）、阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架），均为国产公司制造。

　　1.2主要仪器及设备

　　AR3130电子天平，购自OHAUS公司；HI123A台式酸度测试仪，购自HANNA；MILLIPORE蠕动泵、B6460/B6420培养箱，购自美国Thermo；高速离心机（3K 30），购自SIGMA；生物安全柜，购自苏净安泰；脉动真空灭菌器，购自山东新华；显微镜，购自OLYMPUS；MILLIPOE（50 mm），购自Filter Unite；一次性除菌滤器；GE AKTA蛋白层析系统、GE-FRAC-920部分收集器、层析柱（GE）XK26/20、XK26/100、UV-1800型紫外分光光度计，均购自岛津。

　　1.3动物

　　24～26 g SPF级雌性昆明鼠，由兰州生物制品研究所动物室提供。

　　2方法

　　2.1 B型肉毒毒素复合物柱层析纯化工艺探索

　　分别将透析后上清通过阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）、阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架）柱层析观察纯化效果。

　　2.1.1阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）柱层析[1]

　　称取适量阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）凝胶，用柠檬酸缓冲液浸泡、漂洗，其间换液3次。将浸泡、漂洗过的阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）凝胶缓慢倒入XK26/100层析。层析柱装好后，用柠檬酸缓冲液平衡，流洗过夜。流速1.0 mL/min，压力0.31 MPa。样品为a透析上清，50 mL超量杯进样，用柠檬酸缓冲液，以1.0±0.1 mL/min流速洗脱。放去空流体积，打开收集器，收集穿透峰。打开分光光度计，检测收集管中收集的样品A260和A280值。合并A 260/A280值≤0.65的各管，计量。检测合并液A260和A 280值，并根据A280值计算毒素蛋白浓度。对合并液进行毒力测定，并计算纯度。

　　2.1.2阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架）柱层析

　　量取适量阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架），装入XK26/20层析柱，先用注射用水流洗，再用弱碱性磷酸缓冲液流洗平衡至少1个柱床体积。流速5 mL/min，压力0.5 MPa。样品为b透析上清，样品环进样，用弱碱性磷酸缓冲液，以5.0 mL/min流速洗脱。线性洗脱：收集流穿峰后，取样测定毒力；取1 M NaCl（用弱碱性磷酸缓冲液配制）置入B泵，A泵仍为弱碱性磷酸缓冲液，5.0 mL/min流速洗脱240 min。收集洗脱峰，测定洗脱峰毒力并检测其A260、A 280及A 260/A280值，根据A280值计算毒素蛋白浓度，并取样进行SDS-PAGE，确定目标蛋白峰。待梯度达100%，不再有洗脱峰出现时，更换注射用水洗柱至少2个柱床体积后，停止冲洗，用30%乙醇溶液于2～8℃保存。

　　2.2毒素检测

　　2.2.1肉毒毒素毒力检测方法-昆明鼠尾静脉注射法（Boroff法）[2-3]

　　取24～26 g昆明鼠5只，尾静脉注射0.1 mL待测样品或样品稀释液。用秒表分别记录5只昆明鼠的死亡时间，计算平均死亡时间（控制昆明鼠死亡时间在25～60 min）。根据死亡时间（min）-剂量（LD50/mL）的标准曲线，计算对应毒力。若样品未经稀释，毒力即样品的尾静脉毒力；若样品经稀释，则样品尾静脉毒力（LD50/mL）=样品稀释倍数×查得毒力。

　　2.2.2肉毒毒素毒力检测方法-常规腹腔注射法[4]
       将120 h产毒培养物离心，取上清用明胶弱碱性磷酸缓冲液（GPB）做不同倍数稀释（通过昆明鼠尾静脉注射法评估昆明鼠的腹腔毒力大致范围）。每稀释度腹腔注射24～26 g昆明鼠2只，0.5 mL/只。根据动物96 h内死亡数，计算样品毒力（LD50/mL）。

　　2.2.3 SDS-PAGE

　　参照《中华人民共和国药典：三部》附录IV C SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对柱层析收集样品进行SDS-PAGE分析。

　　3结果

　　3.1柱层析结果

　　批号1阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）出现1个流穿峰。合并各管测量A260/A280值符合条件，毒力较高（见图1）。

　　批号2阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）出现2个流穿峰。合并I峰（目的峰）各管测量A260/A280值符合条件，且毒力较高；合并Ⅱ峰各管测量A260/A280值>0.8，且毒力较低，废弃（见图2）。

　　批号2①、批号2②阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架）出现穿透峰Peak1（以下简称P1），洗脱峰P2～P7共6个峰。通过测试毒力及A260/A280值，确定P2为目的蛋白峰（见图3）。

　　各步柱层析图谱中，峰值为A280。

　　阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）2批毒素阶段收率差异较大，纯度也均未达到1.0×107 LD50/mg；阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架）毒素阶段收率均>60%，纯度均≥2.0×107 LD50/mg（见表1）。

　　3.2 SDS-PAGE结果

　　阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）柱后样品出现5条蛋白条带；阴离子交换层析介质（琼脂糖骨架）柱后P2样品150 kDa条带清晰可见，其余条带少且含量低（见图4）。

　　4结语

　　B型肉毒梭菌产毒培养后通过除菌过滤、酸沉淀、提取、柱层析，形成复合物的纯化过程。阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）为弱碱性填料，价格低、纯化效果好，在工业批量生产中应用广泛，但因性质为干粉状，在装柱前需进行预处理，耗时耗力，且线性流速的最大值仅45 cm/h，进一步延长了实验时间。实验使用阴离子交换层析介质（葡聚糖骨架）纯化B型肉毒毒素复合物，在重复性、电泳分析条带结果上均不是很理想。对此，改用另一种弱碱性阴离子交换剂——琼脂糖骨架（该凝胶为较常用的下游初步纯化介质），并设置高流速、高载量以快速纯化大量粗产品。实验使用1 M NaCl线性洗脱蛋白，对出现的洗脱峰进行毒力测定和电泳分析，发现可较清晰地确定目的蛋白所在的洗脱峰。该步改进在实验重复性及电泳条带分析上均获得较理想的结果，同时纯化后的毒力也得到一定保证。在复合物纯化过程中，较重要的一部分为核酸的去除：核酸pH非常低，约在2.0左右（显著低于缓冲液），且带强负电，柱层析过程中在较高盐浓度下才会被解离。B型肉毒毒素复合物的等电点为5.25，实验中以琼脂糖骨架填料为柱层析介质并用0.1 M NaCl洗脱即可得到目的蛋白，有效将目的蛋白与核酸分离。

参考文献

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　　［2］BOROFF D A,FLECK U.Statistical analysis of a rapid in vivo method for the titration of the toxin of Clostridium botulinum［J］.Journal of Bacteriology,1996,92(5):1580-1581.

　　［3］KONDO H,SHIMIZU T,KUBONOYA M,et al.Titration of botulinum toxins for lethal toxicity by intravenous injection into mice［J］.Japanese Journal of Medical Science&Biology,1984,37(3):131-135.

　　［4］AOKI K.A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A,B,and F in mice［J］.Toxicon,2001,39(12):1815-1820.

　　［5］BEERS W H,REICH E.Isolation and characterization of Clostridium botulinum type B toxin［J］.Journal of Biological Chemistry,1969,244(16):4473-4479.