摘要：目的：分析猪大肠埃希菌采用PCR检测后，其菌株病菌携带情况以及致病原因。方法：于2022年1—12月，从养猪场分离出97株大肠埃希菌，40株从妊娠母猪粪便中分离出来，24株从断奶仔猪粪便中分离出来。分析其不同种群大肠埃希菌的毒力基因携带情况以及致病原因。结果：A组占42.27%、B1组占56.70%、B2组占1.03%、D组占6.19%，B1组为优势组。在40株妊娠母猪大肠杆菌中，EAEC检出8株、EHEC检出2株，共检出10株；在33株哺乳母猪大肠杆菌中，EAEC检出15株；在24株断奶仔猪大肠肝菌中，EAEC检出8株、ETEC检出1株、EPEC检出4株、EAEC-EPEC检出1株；共39株。结论：由于猪大肠埃希菌从粪便中排出，导致猪场周围环境造成严重污染，在宰猪的过程中，不正确的储存猪肉方式以及运送阶段，皆会增加猪大肠埃希菌的感染风险。

　　关键词：大肠埃希菌；聚合酶链式反应；分析

　　0引言

　　猪大肠埃希菌是一种正常的外来病菌，体积最大，作为肠道中的常见病，其别称为革兰氏阳性无孢子菌，大小占比0.5μm×2μm，具有严重的致病性。其中，致病性大肠杆菌可分为两大类，分别为致泻性大肠埃希菌、肠道性大肠埃希菌。在致泻性大肠埃希菌的情况下，有6类[1]：肠道致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）、肠道侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希菌，也称为志贺毒素产生使附着型大肠杆菌扩散的大肠埃希菌（STEC）和肠道聚集性大肠杆菌（EAEC）。其中ETEC会引发数十次小肠水样便，EPEC会导致粪便呈蛋花样；EIEC在结肠会导致腹痛、发热；ETEC会导致肠道小腹泻。STEC是肠道的活跃部分，EAEC可导致腹泻持续，并对结肠部位产生影响[2]。本文将根据大肠埃希菌中16S rRNA基因的特异性，采用PCR检查。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　2022年1—12月，从养猪场分离出97株大肠埃希菌，40株从妊娠母猪粪便中分离出来，24株从断奶仔猪粪便中分离出来。

　　1.2方法

　　1.2.1试剂

　　采购美国Genview公司、青岛海博生物技术有限公司AGAR生产的试剂脑心液培养基；DNA分子量标准DL2000，由美国Takara公司购买；美国公司采购的细菌识别卡、ID肉汤、AST肉汤、AST指示剂；致病性猪大肠杆菌（DEC）核酸检测试剂盒6种，由北京美正生物技术有限公司采购。引物合成单位吉灵米生物技术有限责任公司。

　　1.2.2模板准备

　　将冷冻管的细菌溶液接种在大脑和心脏的固体培养基上，并放置在恒温37℃的培养箱中16 h。选择10个单菌落为基础，与100μL无菌去离子水混合。通过烹饪获得129株大肠杆菌的基因组DNA并用作PCR模板。

　　1.2.3分群检测结果

　　根据李妍等[3]用合成引物对大肠杆菌分离株进行多基因聚类。将大肠杆菌分为A组（CHUA基因和T'spe 4.C2基因的PCR扩增结果均为阴性）、B1组（CHUA基因的PCR放大结果均为阳性，T'spe4.C2 PCR扩增的阳性结果）、B2组（CHUB基因扩增的阴性结果，YJAA基因聚合酶链式反应阳性结果）和D组（CHUA基因酶链反应阳性，YJAA基因聚合酶链反应为阴性）。

　　1.2.4多重PCR方法的特异性检测

　　以C83902，987P为阳性对照，按照方法的优化条件，用多重聚合酶链式反应扩增出肠出血性大肠埃希菌DI933、猪链球菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪巴氏杆菌，以鉴定其特异性。

　　1.2.5多重PCR方法灵敏度检测

　　标准菌株C83902，37℃（140 r/min）培养987P13～15 h，培养液体（103 CFU/mL）按双倍比例稀释。在1.5的条件下，用聚合酶链式反应扩增10～105 CFU/mL不同稀释度的细菌溶液，并测定多重聚合酶链式反应方法的灵敏度。

　　1.2.6通过琼脂糖凝胶电泳鉴定多种PCR产物

　　电泳采用常规琼脂糖凝胶电泳法。PCR反应后，取9μL反应溶液，加入1μL 10×loading buffer加载缓冲液，在16 g/L、120 V、90 mA、20～25 min的琼脂糖凝胶中加入试样，结果通过凝胶成像系统记录。

　　1.2.7 ETEC标准细菌PCR产品测序

　　收集标准菌株经PCR纯化后的产品，将50μL送至上海生物工程技术公司进行纯化测序。

　　1.2.8将PCR检测用于待测菌株

　　处理待测菌株按优化PCR 1.5进行三重PCR处理。

　　2结果

　　2.1大肠埃希菌系统发育聚类结果

　　大肠埃希菌系发育聚类结果见表1。对大肠埃希菌分离的9 7个株进行系统发育群分析。其中A组占42.27%、B1组占56.70%、B2组占1.03%、D组占6.19%，B1组占优势。妊娠母猪分离大肠杆菌40株中，A、B1组最高，B2组1株，D组5株。哺乳母猪大肠杆菌的主要发病群体，在33个大肠杆菌属中，A组和B1组是优势群体，B2组0株，D组1株。24只断奶仔猪大肠杆菌中，B2和D组未检出，B1组16株，A组5株。

　　2.2大肠杆菌病原菌分型分析

　　从表2可知，在40株妊娠母猪大肠杆菌中，EAEC检出8株、EHEC检出2株，共检出10株；在33株哺乳母猪大肠杆菌中，EAEC检出15株；在24株断奶仔猪大肠肝菌中，EAEC检出8株、ETEC检出1株、EPEC检出4株、EAEC-EPEC检出1株；共39株。

　　3讨论

　　大肠埃希菌感染严重危害我国养猪业发展。临床检测均按《食品安全国家标准操作规程》规定，包括常见的传统文化检测方法。传统育种方式由于试验方法复杂、操作效率不高等原因，其应用受到严格限制。酶联吸附免疫（ELISA）的快速测定也是一种常见的细菌测试。同时，抗体系准备时间长，在ELISA检测中存在某些小分子量样品免疫原性不足的问题。大肠杆菌有许多血清型。间接ELISA通常使用整个细菌作为抗原，只检测特定的血清型。聚合酶链式反应技术非常灵敏，易于使用，持续时间短，因此需要使用更多的细菌检测。PCR检测的基本原理是通过改变温度、低温降低过程和中温膨胀来增强DNA模板，循环次数增加25～30次，目标片段可因模板DNA膨胀产物的指数级增加而增加数百万倍，从而使检测灵敏度大大提高。

　　本研究中，A组占42.27%、B1组占56.70%、B2组占1.03%、D组占6.19%，B1组为优势组。从妊娠母猪身上分离到的40株大肠埃希菌中，A、B1组最高，B2组1株，D组5株。33株泌乳母猪大肠杆菌中，A、B1组为优势群，B2组0株，D组1株。24株断奶仔猪大肠杆菌中，A组和B1组为优势菌群，B2组和D组未检出。这表示，养猪业在加强养殖场消毒频次和方法，切断猪大肠杆菌传播，降低猪大肠杆菌检出率的同时，要注意养殖场的环境卫生，对粪便立即进行合理处理[4]。试验表明，断奶仔猪发育缓慢，肠道功能弱，断奶后抗体能力持续下降，导致仔猪无法及时适应饮食变化，免疫力下降，感染大肠埃希菌。为此，需要多注意感染仔猪体内的大肠埃希菌，与从仔猪和母猪中分离的大肠埃希菌不同，断奶仔猪的阳性菌株百分比略高于母猪，也高于用BOK测量的猪毒力的遗传多样性。研究结果符合学者报告[5]。这说明来自仔猪的菌株构成了相当大的毒力基因库，共生猪大肠埃希菌的遗传结构可能会随着宿主生物的进化而增加肠胃外感染的潜在风险。

　　本研究中，大肠埃希菌分离株可分为不同的致病类型。在本研究中，总结了从不同生长周期的大肠杆菌中分离的致病类型的分布，在40株妊娠母猪大肠杆菌中，EAEC检出8株、EHEC检出2株，共检出10株；在33株哺乳母猪大肠杆菌中，EAEC检出15株；在24株断奶仔猪大肠肝菌中，EAEC检出8株、ETEC检出1株、EPEC检出4株、EAEC-EPEC检出1株；共39株。这表明，引起猪腹泻的病原菌主要是ETEC。细菌培养和生化反应通常使ETEC与大肠埃希菌无法区分。血清鉴定后的敏感性和特异性较低，故主要以ETEC是否对肠毒进行检测为依据。目前，常规的猪大肠埃希菌检测方法较为繁琐，检测时间较长，而通过检测毒素基因检测ETEC，应用了这一研究开发的PG扩增系统。此法对猪肠出血性大肠杆菌EDI933、猪链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎弯曲杆菌等均为阴性，可对103 CFU/mL的标准菌种进行稀释液检测[6-8]。因此，临床上对大肠埃希菌肠毒素基因的测定，多重PCR不仅具有较高的特异性、敏感性，而且操作简便、快捷、灵敏，在流行病学研究中也能应用到多重PCR中。

　　由于猪大肠埃希菌从粪便中排出，导致猪场周围环境造成严重污染，在宰猪的过程中，不正确的储存猪肉方式以及运送阶段，也会增加猪大肠埃希菌的感染风险。合理管制猪场环境，采用双重PCR方法检查猪大肠埃希菌，其准确率高，有利于快速诊断，在临床中值得推广及应用。

　　[1]徐翔飞，黄盼，崔雪梅，等．猪大肠埃希菌和沙门氏菌双重PCR检测方法的建立[J]．浙江农业科学，2023，64（4）：957-963.

　　[2]刘俊华，吴玲玲，王雷，等．产肠毒素大肠埃希菌PCR检验方案的优化[J]．中国卫生检验杂志，2022，32（14）：1 681-1 683，1 690.

　　[3]李妍，马一飞．致泻大肠埃希菌Real-time PCR检测案例分析[J].中国城乡企业卫生，2021，36（5）：176-179.

　　[4]刘艳超，王荣敏，谢佳鑫，等．饮用水中大肠埃希菌双重PCR检测方法建立[J]．中国公共卫生，2021，37（3）：574-576.

　　[5]柴洪艳，张家瑞，付璇．PCR试剂盒对致泻大肠埃希菌检测效果的研究[J]．中国城乡企业卫生，2020，35（6）：89-92.

　　[6]刘丽娟，马光强，王伟，等．仔猪腹泻大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析[J]．中国兽医杂志，2019，55（11）：93-96，141.

　　[7]高光平，朱利霞，王洪彬，等．毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立[J]．动物医学进展，2019，40（6）：12-16.

　　[8]路振香，孙坤，夏礼贤，等．病死猪大肠埃希菌与变形杆菌的分离鉴定和药敏试验[J]．动物医学进展，2018，39（2）：134-136.