0引言

　　猪链球菌是一种高致病性的人兽共患病原，可引发败血症、关节炎和脑膜炎等[1]。据调查，越南、中国、法国和泰国养猪场成年猪的猪链球菌总感染率分别为41.0%、40.4%、72.0%和37.0%，给全球养猪业带来了巨大的经济损失[2]。了解猪链球菌的致病机制对于控制其在动物群体中的传播至关重要。

　　猪链球菌的致病性和毒力因子之间存在密切关联。除目前已确定的毒力因子外，猪链球菌潜在的新型毒力因子也是当前研究的重点。PepO是一种金属肽链内切酶，属于M13肽酶家族[3]。研究报道，PepO在肺炎链球菌中与细菌致病性相关，它可以通过逃避宿主的天然免疫系统侵入体内，并帮助细菌躲避补体系统的攻击，增强其对细胞的黏附能力[4-6]。本研究在猪链球菌中也发现了类似的蛋白质，并命名为PepOSS，通过研究PepOSS蛋白对细胞天然免疫的影响，旨在为猪链球菌致病机制的研究奠定理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　猪链球菌2型ZY05719菌株、缺失株△vraSRSS、互补株C△vraSRSS和质粒pET-28a由河南农业大学动物病原与生物安全教育部重点实验室制备保存；DH5α、BL21（DE3）感受态细胞均购于自宝生物工程（大连）公司；镍层析柱购自康为世纪公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自Omega公司；6His单克隆抗体，羊抗兔抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；胎牛血清购自Invitrogen公司等。

　　1.2引物的设计与合成

　　根据GenBank上发布的猪链球菌2型ZY05719的基因组序列（登录号：GCA_000993745.1），利用Primer Premier 5.0软件设计了pepOSS（ZY05719_RS09815）基因特异性引物和细胞因子检测相关引物，见表1。

　　1.3蛋白的表达和纯化

　　以菌株ZY05719（NCBI Reference Sequence:NZ_ CP007497.1）的DNA为模板扩增目的基因。将PCR产物与pET-28a载体进行同源重组。鉴定出阳性菌株送尚亚生物测序。将pET-28a-pepOss重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行培养。当菌液生长至对数生长期后，加入IPTG（终浓度为0.7 mmol/L），低温诱导蛋白表达12 h。收集细菌沉淀，超声破碎。将含蛋白的上清液置于镍柱中，在室温下用3D混合装置混合2 h，使混合物向下流动并收集。采用20、50、100、200、500 mmol/L的咪唑洗涤过滤柱，通过SDS-PAGE筛选出最佳咪唑洗脱浓度。然后将洗脱液在PB溶液中透析过夜，第2天蔗糖浓缩。纯化的PepOss蛋白经Western blot鉴定。

　　1.4多克隆抗体的制备

　　将纯化的PepOSS蛋白与Montanide ISA-201佐剂按等体积比混合，确保充分乳化。然后在每只新西兰白兔的背部多次注射0.5 mg蛋白进行免疫接种。初次免疫后，分别在第2周进行第2次、第4周第3次和第6周第4次加强免疫。第4次免疫1周后采血，采集的血液先在37℃下放置1 h，然后在4℃下放置过夜。分离血清，3 000 r/min离心5 min，-40℃保存。利用间接ELISA测定抗体血清效价检测。

　　1.5 Western blot试验

　　PepOSS蛋白样品经SDS-PAGE分离电泳后，将目标蛋白条带转移到NC膜上进行半干转录（24 V，200 mA，30 min）。然后用5%脱脂奶粉37℃阻断非特异性结合位点1 h，4℃条件下用稀释比例为1:2 000的一抗（多克隆抗体阳性血清）孵育过夜。PBST缓冲液洗涤5次，每次5 min后，与稀释比例为1:3 000的二抗（羊抗兔）在室温下孵育2 h。PBST缓冲液洗涤5次，每次洗涤5 min，随后显色并观察结果。

　　1.6荧光定量PCR

　　使用TRIzol法提取样品RNA，将提取的RNA按照HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书方法反转录为cDNA。对所获得的的cDNA样本进行荧光定量PCR分析。其中以β-actin/parC作为内参照基因，检测相应基因转录水平，每个样品进行3次生物学重复，并使用2-ΔΔCT法计算转录差异。

　　1.7巨噬细胞吞噬试验

　　将3D4/21细胞吹成单细胞悬液，接种于24孔细胞培养板中。细胞培养至形成单层。将ZY05719菌株接种到THB液体培养基中，进行培养直至细菌进入对数生长期。在4℃条件下以5 000 r/min的速度离心5 min，使用PBS洗涤3次，并用DMEM重新悬浮细菌。将菌液加入细胞培养板中（MOI=20:1）。在室温下800 r/min离心10 min，在含5%CO2的37℃培养箱中孵育1.5 h。随后，将细胞培养板上清弃去，用PBS清洗3次。然后加入500μL含有庆大霉素（100μg/mL）和青霉素（5μg/mL）的DMEM培养基，37℃孵育1.5 h。孵育后，弃上层液体，再用PBS洗3次。在培养板中加入1 mL ddH2O，室温裂解细胞10 min，反复吹吸促进细胞裂解。接着对裂解液进行一系列的梯度稀释，并将其涂抹在THB平板上，在37℃的培养箱中孵育过夜。第2天，计数THB平板上的细菌数量，计算细菌的抗吞噬率。在整个试验过程中，每个样品设置了3次平行测量，并进行了3次生物重复，以确保数据的准确性。

　　1.8统计分析

　　利用GraphPad Prism 5软件进行数据分析和部分图形绘制。使用双尾不成对Student's t-test进行2组数据间的差异分析。结果以P＜0.05为差异显著。

　　2结果

　　2.1猪链球菌PepOSS蛋白结构分析

　　在猪链球菌中发现一个新的金属肽链内切酶基因（ZY05719_RS09815），将其命名为PepO SS，可编码660个氨基酸，大小约71 kDa。SMART软件分析PepO SS属于肽酶M13家族（图1A）。序列比对结果表明，PepO SS与已鉴定的猪链球菌肽链内切酶PepO蛋白（ZY05719_RS00900编码）相似性为29%（图1B），PepOSS在猪链球菌中发挥什么样的生物学功能有待进一步研究。与其他链球菌的M13家族蛋白一样，PepOSS具有参与底物/抑制剂相互作用（VNAYY）和金属配位（HEISH和ENVAD）的特征性元件（图1C、图1D）。

　　2.2猪链球菌PepOSS蛋白原核表达

　　以菌株ZY05719的基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的片段，并通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果显示在大约1 893 bp处有目的条带出现（图2A）。将目的基因与原核表达载体pET-28a进行同源重组（图2B），并将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。随后，在16℃的条件下，使用终浓度为0.7 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达12 h。将得到的纯化PepOSS蛋白经SDS-PAGE电泳验证，如图2C所示，在大约72 kDa处存在1条明显条带，且此泳道无其他杂蛋白条带，表明得到的蛋白较纯。随后又进行了Western blot检测，结果显示表达的PepOSS蛋白可与His单克隆抗体发生反应（图2D）。

　　2.3 PepOSS蛋白多克隆抗体的制备

　　用PepO SS蛋白免疫新西兰大白兔4次后，收集血清，用间接ELISA检测抗体效价。如图3A所示，在血清稀释12 800倍后，吸光度（A）值大于对照组的2.1倍（P/N＞2.1），说明多克隆抗体的效价为1:12 800。通过Western blot试验，将PepOSS蛋白与制备的多克隆抗体血清进行孵育，结果显示在大约72 kDa处有明显条带（图3B），表明制备的抗体与PepOSS蛋白有很好的反应原性。随后利用激光共聚焦技术对PepOSS蛋白进行定位。如图4所示，用阳性血清可在细菌表面检测到PepOSS蛋白，阴性血清未检测到。

　　2.4 PepOSS蛋白引起3D4/21细胞天然免疫应答反应

　　有研究报道，肺炎链球菌PepO蛋白可激活宿主的免疫应答，从而影响肺炎链球菌的致病性[6]。本研究将PepO S S蛋白与猪肺泡巨噬细胞3D4/21共同孵育后，使用荧光定量技术对3D4/21的IL-6、TLR4、mir-155、IL-1β、ship1等细胞因子的表达量进行分析。结果如图5所示，经过PepO SS蛋白刺激后，3D4/21细胞中的IL-6、TLR4、CXCL10细胞因子的mRNA表达量显著增加，与PBS相比以剂量依赖的方式显著升高。用PepOSS蛋白处理3D4/21细胞6 h后，与PK和HK蛋白相比可显著增强细胞的吞噬作用（图6）。上述研究表明PepO SS蛋白在3D4/21细胞的免疫反应中发挥了激活的作用。

　　2.5二元信号转导系统VraSRSS调控pepOSS基因的表达

　　猪链球菌二元信号转导系统VraSRSS是细菌重要的多级信号传导系统，在转录水平调控细菌基因表达，参与细菌的耐药与致病作用。前期转录组数据发现，VraSRSS系统的缺失导致pepOSS基因的上调表达[7]。本次利用荧光定量方法证实，将VraSRSS缺失后pepOSS基因表达水平上升约7倍，而互补株C△vraSRSS中pepOSS基因表达水平与野生株一致（图7）。上述研究表明，pepOSS基因的表达受二元信号转导系统VraSRSS调控。

　　3讨论

　　猪链球菌在猪群中的流行情况十分复杂，常引起急性发热、脑膜炎、关节炎和败血症等症状，严重影响了养猪业的经济效益[8]。猪链球菌能够有效侵入宿主的多种微环境并在其中生存，这表明猪链球菌采用了高效的策略以规避宿主免疫防御机制。深入研究猪链球菌与宿主免疫应答的机制，对于制定更加有效的防控策略具有重要意义。

　　金属肽链内切酶在细菌中广泛存在，参与多种生理过程，如蛋白质降解、信号传导、免疫反应等[9]。化脓性链球菌PepO通过结合C1q参与补体逃避，可有效帮助细菌抵抗宿主免疫应答[10]。在对肺炎链球菌PepO蛋白研究中发现，它可通过TLR2和TLR4介导的信号通路，参与激活宿主的免疫应答，从而影响肺炎链球菌的致病性[6]。本研究在猪链球菌中鉴定了一个新的金属肽链内切酶PepOSS，对其进行原核表达，并探究了其对天然免疫的影响。与肺炎链球菌PepO蛋白作用相似，猪链球菌PepOSS蛋白与3D4/21细胞互作后，IL-6、TLR4、CXCL10等细胞因子的mRNA表达量显著增加。细胞因子的过度分泌会引起机体产生炎症风暴，对宿主细胞产生严重损伤。证实PepOSS能作为一种效应因子参与宿主天然免疫反应的激活。上述试验为后续PepOSS相关信号通路研究奠定了理论基础，也为猪链球菌致病机制的研究提供了依据。

　　二元信号转导系统一般包含2个蛋白，传感器激酶（HK）和反应调节因子（RR），可在转录水平调控靶标基因，影响RNA聚合酶结合启动子[11-12]。前期研究已证实，二元信号转导系统VraSRSS参与多个基因的调控，在猪链球菌致病性方面发挥作用[7]。试验表明，将VraSRSS缺失后pepOSS基因表达水平显著上调，提示pepOSS基因的表达受二元信号转导系统VraSRSS调控。

　　4结论

　　本研究证实猪链球菌PepOss蛋白可有效激活细胞的免疫反应，并且pepOSS基因的表达可受二元信号转导系统VraSRSS调控。上述结果可为猪链球菌致病机制的研究提供理论基础。

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