摘要：该研究旨在筛选出1株对猪子宫内膜炎主要病原菌综合拮抗效果最好的产细菌素乳酸菌。结合形态特征与16S rRNA测序分析对蔬菜源乳酸菌（MR5）进行菌种鉴定。对MR5细菌素粗提物进行不同温度、酸碱、蛋白酶处理试验，分析其细菌素理化特性。通过全基因组测序分析，评估MR5的生物安全性。结果表明，经鉴定MR5为乳酸明串珠菌，其细菌素在121℃超高温处理下仍能够保持较高的抑菌活性，在4～10的宽范围pH值环境下能够保持良好的抑菌性，对胰蛋白酶、蛋白酶K较为敏感。MR5基因组中不含有抗生素抗性基因，具有良好的生物安全性。综上可知，MR5细菌素有良好的稳定性，对目标菌株有强效的抗菌活性，有望被研发为治疗猪子宫内膜炎的新型药物。

　　关键词：子宫内膜炎；细菌素；全基因组测序

　　0引言

　　猪子宫内膜炎是一种常见的母猪产科疾病，多因金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌等病原微生物感染引发。患病母猪常表现出食欲减退、不规则发情、泌乳量下降、不孕等现象，大多数母猪被淘汰处理，极大浪费了繁殖母猪的生产性能。由于近年抗生素的滥用，致病菌耐药性不断增强，治疗难度与成本大大增加，因此寻找一个绿色新型的替抗产品至关重要。细菌素是一种由细菌核糖体合成的具有抑菌活性的小肽，主要通过破坏靶细胞的细胞壁或细胞膜，导致细胞内容物泄露，以发挥其抑菌作用。本研究筛选出1株对猪子宫内膜炎主要病原菌综合拮抗效果较好的乳酸明串珠菌，探究其细菌素理化特性并评估该菌株的生物安全性，为猪子宫内膜炎的防治寻找更高效、安全的方案。

　　1材料与方法

　　1.1菌株来源

　　指示菌：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌PG-2、猪链球菌ZL-1，均由吉林农业科技学院动物科技学院动物微生物与免疫研究室保藏。乳酸菌MR5由来自延边的蔬菜样品中分离纯化得到。

　　1.2试验方法

　　1.2.1乳酸菌的分离纯化

　　取适量市售的酸菜、蔬菜等食源性样品，在无菌条件下分别涂布于MRS固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养24 h；在平板上挑取不同形态单菌落进行划线纯化，革兰氏染色观察纯化后的分离菌株并进行增殖培养，甘油保菌并在-80℃冻存。

　　1.2.2产细菌素拮抗菌株的筛选

　　各取1 mL菌液接种于300 mL MRS肉汤中，于摇床中37℃恒温培养24 h；取菌液，6 000 r/min离心15 min，使用0.22μm微孔滤膜和真空抽滤泵抽滤得到发酵上清液，使用旋转蒸发仪将其进行浓缩至30 mL得到无细胞浓缩上清液；使用1 mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值均调为6，再加入过氧化氢酶至终浓度为1 mg/mL，37℃水浴2 h，使之充分反应后沸水浴煮5 min，排除有机酸和过氧化氢的干扰。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌为指示菌，将3种指示菌菌液浓度调为1×108 CFU/mL左右，对经上述处理的不同乳酸菌浓缩发酵液，使用琼脂扩散法进行抑菌试验，比较抑菌圈大小，筛选出1株优良的拮抗菌株继续后续试验。

　　1.2.3优良拮抗菌株的菌种鉴定

　　将1.2.2中筛选出的乳酸菌命名为MR5。用细菌DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA；使用细菌16S rRNA通用上下游引物27F（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）进行聚合酶链式反应（PCR），扩增条件为94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30个循环，72℃1 min；扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至吉林省库美生物科技有限公司测序，测序菌株基因序列在NCBI数据库中进行同源性比对。

　　1.2.4乳酸菌MR5细菌素理化特性探究

　　细菌素的粗提取：取1.2.2中得到的无细胞浓缩上清液加入至1 kD截留分子量的透析袋中，将其放入500 mL ddH2O中浸泡过夜，将透析产物分别浓缩至30 mL，并以金黄色葡萄球菌为指示菌，无细胞浓缩上清液为对照，采用琼脂扩散法测定其抑菌活性。

　　细菌素稳定性检测：以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法，分别以未做过任何处理和经过以下方式处理的细菌素粗提物作为空白对照组、试验组，每组设置3个重复试验。取等量细菌素粗提物分别在40、60、80、100、121℃温度下处理30 min，冷却至室温。使用适宜浓度的乳酸和氢氧化钠溶液将其pH值分别调为2、4、6、8、10，37℃水浴4 h后将pH值调回原细菌素粗提物测量pH值（pH=4.1）。分别加入终浓度为1 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，37℃水浴4 h，充分反应，最后100℃煮沸5 min使蛋白酶失活。

　　1.2.5乳酸菌MR5全基因组测序分析

　　取适量MR5菌液接种于MRS肉汤中，37℃培养24 h，取菌液4℃、4 000 r/min离心45 min，弃上清液取菌体沉淀，送至青岛百迈克生物科技有限公司（Biomarker Technologies）完成建库、测序及生物信息学分析。

　　2结果与分析

　　2.1产细菌素拮抗菌株的筛选

　　在泡菜、蔬菜等食物源样品中分离出20株乳酸菌，根据各菌株排酸、排过氧化氢处理后的无细胞浓缩上清液对3种指示菌的抑菌效果，综合筛选出1株对3种指示菌拮抗效果皆优良的产细菌素乳酸菌，见图1。

　　2.2优良拮抗菌株的菌种鉴定

　　菌株MR5在MRS固体培养基上形成乳白、光滑、略有隆起的圆形菌落（图2），革兰氏染色后镜检观察到成对或短链状排列的阳性短杆（图3）。菌株的16S rRNA测序结果与NCBI数据库同源性比对，该菌株与乳酸明串珠菌3934相似度高达98.27%，乳酸菌MR5被鉴定为乳酸明串珠菌。

　　2.3乳酸菌MR5细菌素理化特性探究

　　2.3.1 MR5细菌素粗提取

　　对照组、小于1 kD以及大于1 kD透析产物浓缩液抑菌圈直径分别为30、30、17 mm，因此选择小于1 kD透析产物为MR5细菌素粗提物完成后续试验。

　　2.3.2 MR5细菌素稳定性

　　由表1可知，MR5细菌素在高温处理下抑菌效果虽有所下降但仍具有较高的抑菌活性，具有较好的热稳定性；MR5细菌素经酸碱处理后发现其在4～10的宽pH值范围内是稳定的，在pH值为2的酸性环境中其抑菌能力有所降低；经蛋白酶处理后发现其在胰蛋白酶和蛋白酶K作用下抑菌效果降低较明显，可推测其蛋白质性质。

　　2.4乳酸菌MR5全基因组测序分析

　　2.4.1 MR5基因组基本信息

　　MR5全基因组测序测序分析，MR5染色体基因组大小为1 714 317 bp，基因组平均GC含量为43.39%，具体统计结果见表2。

　　2.4.2 CARD数据库注释

　　生物安全性是细菌素能否应用于兽医临床治疗的一大考量要素。CARD数据库以ARO（Antibiotic resistance ontology）为分类单位并关联抗生素及其靶信息、耐药机制、基因变异、与耐药/毒力基因相关的可移动元件等信息，已成为目前最受科研工作者青睐的耐药基因研究工具之一。菌株MR5的CARD数据库注释基因为0，不含有抗生素抗性基因，较大程度规避了耐药基因传播的风险。

　　3讨论与结论

　　随着耐药致病菌数量的增加，明串珠菌所产细菌素作为新型抗菌剂在生物医药领域上的应用也逐渐被人关注。本研究筛选出的乳酸明串珠菌MR5，其细菌素具有良好的稳定性与抑菌活性，有望成为治疗猪子宫内膜炎的新型替抗药物。

　　近年，微生态制剂成为猪子宫内膜炎非抗生素疗法中的热门研究方向。主要通过乳酸菌竞争性黏附在宿主细胞的表面同时产生乳酸、过氧化氢、细菌素等代谢产物以达到抑制病原菌、维持微生态平衡的主要治疗作用。但活菌制剂对体内环境的要求较为苛刻，在高温或酸性等环境下易失活，其益生性能也将大打折扣。与之相比较，细菌素制剂导致耐药性缓慢或有限出现、稳定性、高效性可以很好地弥补其短板，另外细菌素的主要优点还包括其核糖体合成的性质，这使它们适合生物工程策略。这种生物工程变体不仅有利于其规模化工业生产还可能能够改善其物理化学特性，例如提高溶解度、蛋白酶抗性和pH值耐受性等，进一步提高其作为新型抗菌剂的价值和有效性。因而使用细菌素制剂以子宫冲洗等方法治疗猪子宫内膜炎也具有很高的研究价值。

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