摘要：2023年12月8日广西某奶牛场出现有5～6头泌乳母牛有流浓鼻涕、呼吸急促、体温升高现象，奶量急速下降，且疾病具有传染性，牛群出现死亡现象，对病死牛解剖观察发现病死牛呈现全身败血性病变，初步还以为细菌性感染，为进一步确诊病原，无菌采集牛肺、肝脏、脾脏、肠道、血液、粪便、鼻液等样品病原PCR检测和细菌分离，对分离菌进行16S rRNA扩增鉴定以及混菌药敏试验。结果显示样品病原PCR检测中多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌呈阳性，分离得到2株菌，经16S rRNA扩增鉴定这2株菌分别为多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌，混菌药敏试验显示这2株菌对大观霉素、恩诺沙星、环丙沙星、头孢噻呋较为敏感，对卡那霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多粘菌素中度敏感。根据临床和实验室诊断确认此次疫情是由多杀性巴氏杆菌与化脓隐秘杆菌混合感染，为及时准确采取针对性治疗措施提供了参考。

　　关键词：多杀性巴氏杆菌；化脓隐秘杆菌；PCR；牛

　　0引言

　　牛巴氏杆菌病是一种急性热性传染病，由多杀性巴氏杆菌所引起的，该病具有发病急、病程短、死亡率高的特点，对养牛业造成重大损失[1]。多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌是牛呼吸道疾病综合征主要病原之二[2]。BRDC是牛养殖业中较为常见且对经济影响较大的疾病。

　　现发现广西某奶牛场的牛从12月8日相继出现食欲减退或者废绝，消瘦，精神萎靡，目光呆滞，有的鼻孔流涕、口腔流涎，喘气、呼吸困难、腹式呼吸，泌乳停止。病初主要是产奶牛发生，随后扩散传播至全群，发病急、传播快、病程短，累计发病约200头，死亡5头。病死牛呈现全身败血性病变，鼻孔、肛门等天然孔有少量红色血液流出，喉头、气管出血，肺脏气肿、出血和坏死，肺脏表面有纤维素性渗出和胸壁粘连，心外膜出血，肝脏边缘钝圆，胆囊充盈，肠系膜淋巴结水肿，十二指肠、空肠严重出血。从临床症状初步怀疑为传染性极强的多杀性巴氏杆菌引起的疾病。为确认此次牛群发病主要的病原体，进行实验室诊断如下，以便对症治疗科学预防。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1病料来源

　　广西某奶牛场病死牛解剖组织包括牛肺、肝脏、脾脏、肠道、血液、粪便和鼻液。

　　1.1.2主要试剂

　　细菌DNA提取试剂盒、病毒DNA/RNA提取试剂盒，2xEs Tag MasterMix（Dye）均购自北京康为世纪生物科技有限公司，琼脂糖购自Biowest公司，DL2000 DNA marker购自宝日医生物技术有限公司，血平板购自广东环凯微生物科技有限公司，营养琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂均购自海博生物青岛海博生物技术有限公司，药敏试纸购自河南利飞驰生物技术有限公司，本研究所用的相关引物均由：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

　　1.1.3主要仪器设备

　　超净工作台、恒温培养箱、PCR仪（博日科技），电泳仪（广州道一），凝胶呈像仪（UVITEC）、台式高速冷冻离心机（eppendorf）。

　　1.1.4引物设计

　　根据已发表的参考文献[3]中多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌的引物以及参考文献[4]中细菌通用引物16S rRNA送至生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息见表1。

　　1.2方法

　　1.2.1样品病原PCR检测

　　无菌采集病死牛组织，用点燃的酒精棉球擦拭表面后用无菌手术刀划开表层取小块病变深部组织，在无菌研钵中研磨装入含PBS缓冲液的离心管中，反复冻融3次后用北京康为世纪生物科技有限公司病毒DNA/RNA提取试剂盒按照说明书提取研磨后的组织核酸，并以此为模板，分别用特异性引物进行PCR扩增，试验用到的引物序列信息如表1。PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，ddH2O 7.5μL，基因组模板3μL。PCR扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，50℃、退火时间参照引物序列信息表，扩增完成取6μL产物进行1.5%浓度凝胶电泳。

　　1.2.2细菌分离培养

　　无菌环境下采集病死牛肺、肝脏、脾脏、肠道等病料的病健交界处的小块组织，接种到提前高压灭菌好的肉汤培养基中37℃培养18～48 h后观察其生长情况，后将其在血平板和麦康凯固体平板上划线，37℃培养18 h后，观察细菌生长情况和形态，然后在固体培养基上，挑取单个菌落进行纯化培养。

　　1.2.3细菌药敏试验

　　采用KB纸片法对分离菌进行混合药敏试验，将分离菌的菌液进行1∶1混合后用纯净水100倍稀释，将其涂布于固体营养培养基上，贴上药敏纸片，37℃培养16 h观察并测量抑菌圈大小，判断病原菌耐药性。

　　1.2.4分离菌16S rRNA鉴定

　　参照北京康为世纪生物科技有限公司的细菌基因抽提试剂盒对分离纯化的病原菌进行核酸抽提，将抽提的核酸作为基因模板用通用引物对病原菌的16S rRNA进行扩增，PCR扩增体系（总体积为25μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，ddH2O 7.5μL，基因组模板3μL。PCR扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸3 min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶（浓度为1%）电泳。将鉴定条带位置正确的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

　　2结果

　　2.1样品病原PCR检测结果

　　将组织样品研磨抽提核酸作为模板用特异性引物进行PCR检测结果显示扩增出456 bp条带，检测结果为多杀性巴氏杆菌阳性。

　　2.2病原菌分离培养结果

　　将病死牛的肺脏等组织分别接种血平板和麦康凯平板进行细菌分离培养得到2株菌，分离菌1在血平板上经37℃18 h培养长出圆形光滑，中间稍微突起的水滴样菌落，在麦康凯平板上不生长。分离菌2在血平板上经48 h培养后长出圆形半透明菌落，有溶血现象。

　　2.3混菌药敏结果

　　药敏试验抑菌圈大小见表2，分离的病原菌对大观霉素、恩诺沙星、环丙沙星、头孢噻呋较为高度敏感，对卡那霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多粘菌素中度敏感。

　　2.4分离菌16S rRNA鉴定结果

　　经过分离纯化培养或2株分离菌经细菌16S rRNA扩增测序经过与NCBI数据库比对鉴定，分离菌株1与多杀性巴氏杆菌参考株均具有较高同源性，分离菌株2与化脓隐秘杆菌参考菌株均具有较高同源性。

　　3治疗

　　牛场兽医技术团队到疾病现场第一线对病牛进行诊断分析，并根据以往病例诊断治疗的经验，进行科学的临床初步诊断，初步判定为传染性极强多杀性巴氏杆菌感染，在发病的第一时间做出治疗方案，首先进行病健隔离分群，针对轻微的病牛牛采用中药治疗方式。对严重的病牛采取隔离措施，并用敏感性药物治疗。发现有牛相继感染，有群发感染之势，根据检测结果和牛场疾病情况愈发严重的情况下，立即采取应急措施对全群牛进行多杀性巴氏杆菌疫苗注射，对被传染的病牛进行针对性的隔离和抗生素治疗。对于场地也进行了全面消杀，以防环境中的病原菌持续侵袭牛群。仅仅6 d，疫情得到完全控制。

　　4讨论

　　多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌均为条件致病菌[5]，由于感染牛作为传染源最终会传染给其他健康牛以及环境中的病原菌也会侵袭健康牛而造成大范围的感染。本次疫情发生于冬季，极有可能是由于天气寒冷等原因造成牛机体抵抗力下降使病原菌有机可乘。

　　在临床上，多杀性巴氏杆菌引起的牛疾病可分为败血型、肺炎型和水肿型。猝死为败血型的主要特征，而水肿型和肺炎型多是在败血型的基础上发展而来，因此在临床上以肺炎型为主的混合型最为常见[6]。在本次牛场疫病中发现病死牛存在明显的全身性败血症状，病程较急，天然孔有流血，肺脏气肿、出血和坏死，肺脏表面有纤维素性渗出和胸壁粘连，呈败血型与肺炎型的混合型。化脓隐秘杆菌作为条件致病菌，常在动物处于不利条件如饲养条件不卫生，天气骤变和受伤等机体免疫力下降时侵害动物导致肺炎和乳房炎，奶牛产奶量下降、停止泌乳甚至动物死亡，造成严重经济损失。

　　该场在确诊后立即对牛群进行分群治疗，采取疫苗免疫联合抗生素治疗方法对感染牛进行抗生素治疗，且即时给全牛群注射疫苗，对牛场进行了全面消杀，改善牛群所处环境有益于牛群抵抗疾病。由于对细菌病频繁使用抗生素治疗或者没有按照正确的方法给药导致一些细菌出现耐药性，目前对于这多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌的疾病均以预防为主。在平时加强饲养管理如定期消杀场地，饲养密度不宜太高，注意通风等。为防止外源性的病菌入侵，在引进动物时需进行长时间隔离和免疫方可合群。

　　5结论

　　多杀性巴氏杆菌为条件致病菌，天气骤变、季节交替、昼夜温差较大、牛舍拥挤潮湿空气不流通、牛饲养环境不卫生以及运输不科学等诱因都可引起牛机体免疫力降低发生内源性感染。感染牛以高热、肺炎、急性肠炎以及内脏器官广泛性出血为主要特征，故牛巴氏杆菌病又称为出血性败血症[7]。多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性菌，外形呈短杆状或球杆状，有荚膜、无鞭毛，在外界环境下，可以通过患病动物的排泄物、分泌物以及蚊虫等媒介传染给其他健康动物。化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）属隐秘杆菌属，也称化脓棒状杆菌（Corynebacterium pyogenes），是一种无荚膜无鞭毛的革兰氏阳性杆菌。该菌可感染多种动物，在一定的条件下动物机体免疫力较低时发病，可引起化脓性感染，常表现为子宫内膜炎、肺炎、关节炎、乳房炎，引起肉牛和高产奶牛的肝肾脓肿及泌乳量下降或停止泌乳、猪的肺炎等，给养殖业带来较大的经济损失[8]。

　　本次疫情从临床症状和解剖病变结合本次实验室诊断结果确诊为多杀性巴氏杆菌与化脓隐秘杆菌混合感染，经过科学的治疗，本次疫情在6 d内得到了控制并渐渐好转。

　　参考文献

　　[1]吉晓伟．浅析牛出血性败血病的综合防治[J]．中国畜禽种业，2022，18（2）：163-164.

　　[2]梁晓珊，宁鹏，赵辉，等．牛呼吸道合胞体病诊断和预防研究进展[J]．中国兽医杂志，2023，59（6）：112-116.

　　[3]吴翠兰，彭昊，李军，等．2016—2017年广西牛呼吸道疾病综合征病原学的调查研究[J]．中国畜牧兽医，2018，45（12）：3 535-3 544.

　　[4]韩林梅．广西牛羊主要呼吸道疫病调查[D]．南宁：广西大学，2018.

　　[5]张建武．一例牛多杀性巴氏杆菌病的诊治[J]．北方牧业，2023（8）：44.

　　[6]杨依波．临沧市牛呼吸道综合征细菌性病原的分离与鉴定[D].昆明：云南农业大学，2023.

　　[7]次仁卓嘎．牛多杀性巴氏杆菌病的防治[J]．中兽医学杂志，2022（4）：11-13.

　　[8]漆亚芝，董捷．浅谈化脓隐秘杆菌的研究进展[J]．广西畜牧兽医，2021，37（4）：191-192.