摘要：建立基于基质分散固相萃取（MSPD）—高效液相色谱法（HPLC）同步检测鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺残留的快速、高效、经济的方法。鸡蛋样品经甲醇—乙腈混合溶液提取，利用200 mg十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）和50 mg N-丙基乙二胺（PSA）混合分散固相萃取粉末净化，C18色谱柱分离，纯水—乙腈作为流动相进行梯度洗脱，外标法进行定性定量分析。结果表明，氯羟吡啶和二硝托胺在0.025～50.0μg/mL范围呈良好的线性关系（R2＞0.999），检出限为0.025 mg/kg和0.050 mg/kg，定量限为0.075 mg/kg和0.100 mg/kg。在0.1、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg水平的加标回收试验中，氯羟吡啶的回收率为87.70%～101.78%，相对标准偏差（RSD）为0.66%～5.41%；二硝托胺的回收率为84.99%～97.11%，RSD为0.95%～5.34%。该方法简便、净化效果好、回收率高，适用于鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺药物的同步定量检测。

　　关键词：固相萃取；高效液相色谱法；药物；残留

　　0引言

　　氯羟吡啶和二硝托胺都是抗球虫药物，因防治球虫效果好，价格便宜，毒性较小得到普遍使用，但长期使用或不按规定使用会造成禽产品药物残留，对人体健康造成潜在危险。为保障动物源性食品安全，欧盟、美国、日本和中国等都制定了多种动物组织中氯羟吡啶和二硝托胺的最高残留限量标准，我国GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定氯羟吡啶和二硝托胺在鸡肉中的最大残留限量分别为5 000μg/kg和3 000μg/kg[2]，尚未制定两者在鸡蛋中的最高残留限量。

　　为防止蛋鸡养殖过程中滥用抗球虫类药物，避免食品安全恶性事件发生，建立一种同步、快速检测鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺的检测方法尤为重要。目前，动物组织中氯羟吡啶和二硝托胺的残留检测方法主要有超高效液相色谱法[3]、液相色谱—质谱法[4]和气相色谱—质谱法[5]等。但这些方法主要是针对单一药物检测，尚未建立同步检测鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺的检测方法。前处理主要采用经典的固相萃取净化技术，此法虽然重现性好，但步骤繁琐、成本较高，不利于大批量样品快速检测。本研究采用基质固相分散萃取技术，建立鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺残留同步测定的高效液相色谱法，该法前处理不需要使用固相萃取小柱，样品提取、净化操作简便，回收率较高，成本较低，更适合大批量样品的快速分析检测。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氯羟吡啶标准品（纯度99.90%，美国PANPHY公司）；二硝托胺标准品（纯度99.7%，中国兽医药品监察所）；N-丙基乙二胺固相吸附剂（40～60μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；十八烷基硅烷键合相吸附剂（上海昕泸实验设备有限公司）。

　　1.2仪器与设备

　　E2695高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（美国Waters公司）；Multifuge X1R Pro高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；MS105电子天平（精度为0.000 01 g）、Me 2002t电子天平（精度为0.01 g）[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]；QL-901涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DTC-27F超声波清洗器[鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司]；S-LD156型打蛋器（九阳股份有限公司）。

　　1.3试验方法

　　1.3.1样品制备

　　取适量新鲜或冷藏的鸡蛋，打开并用打蛋器搅匀，装入样品袋后保存于-20℃冰箱中备用。

　　1.3.2样品的处理及测定

　　称取2.0 g鸡蛋样品于50 mL离心管中，先加入1g氯化钠，再加入10.0 mL甲醇和5.0 mL乙腈，快速涡旋1 min，超声提取10 min，8 000 r/min以上转速离心5 min。准确吸取5.0 mL上清液于15 mL离心管中，加入200 mg C18和50 mg PSA，振荡混匀30 s，8 000 r/min以上转速离心3 min，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱仪测定。

　　1.3.3色谱条件

　　色谱柱：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；检测波长：266.0、244.6 nm；柱温：室温；进样体积：20μL；流动相A为纯水，流动相B为乙腈。具体洗脱程序见表1。

　　2结果与分析

　　2.1检测波长的选择

　　GB/T 20362—2006和农业部783号公告《饲料中二硝托胺的测定高效液相色谱法》中检测氯羟吡啶和二硝托胺分别采用270.0 nm波长和245.0 nm波长。为获得更为理想的分析条件，取甲醇配制的氯羟吡啶和二硝托胺质量浓度均为10μg/mL混合标准溶液，按本研究优化的色谱条件，利用液相二极管阵列检测器对2种目标分析物进行光谱扫描，发现氯羟吡啶在216.3 nm和266.0 nm有最大吸收峰（图1），二硝托胺在244.6 nm有最大吸收峰（图2），本研究选择266.0 nm和244.6 nm作为氯羟吡啶和二硝托胺的检测波长。

　　2.2流动相的优化

　　分别考察纯水—乙腈、0.05 mol/L甲酸铵水溶液-乙腈和磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）-乙腈3种不同洗脱体系对氯羟吡啶和二硝托胺的分离能力。结果表明，3种流动相对2种药物都有较好的分离效果，色谱峰对称，半峰宽较窄，响应值高，但考虑到甲酸铵水溶液和磷酸盐缓冲溶液不仅配制繁琐，还容易出现盐析现象，导致管路堵塞，影响色谱柱寿命。为保护色谱柱和缩短检测时间，本研究选择纯水—乙腈梯度洗脱，不仅可缩短出峰时间，还能有效分离目标峰。在优化色谱条件下，鸡蛋添加样品的色谱图（图3），从图中可知氯羟吡啶和二硝托胺的峰型较好，分离度高，未见杂质干扰峰。

　　2.3提取溶剂的优化

　　参考GB/T 20362—2006，选用甲醇、乙腈和甲醇—乙腈混合溶液提取鸡蛋中的氯羟吡啶和二硝托胺。当用乙腈提取时，氯羟吡啶的回收率低于30%；当用甲醇和甲醇—乙腈混合溶液提取时，氯羟吡啶的回收率范围在85%～93%；而二硝托胺在3种提取剂的回收率范围均在86%～95%。由于鸡蛋样品杂质较多，甲醇能保证氯羟吡啶和二硝托胺回收效率，乙腈能较好除去鸡蛋样品的高蛋白杂质，为达到更好的提取效果，本研究选择甲醇—乙腈混合溶液作为提取剂。

　　2.4净化剂的优化

　　MSPD净化技术与传统的固相萃取方法相比较，具有快速、高效、成本低等优势，是动物源性食品中药物残留分析领域较为简单、快速的方法。本研究选择常用的C18和PSA固相分散萃取材料，分别考察250 mg C18、200 mg C18+50 mg PSA和250 mg PSA不同配比的吸附剂净化能力，氯羟吡啶在前2种净化剂的回收率范围为87%～94%，在后者的回收率只有62%左右，二硝托胺在3种净化剂的回收率均高于85%。由于鸡蛋样品基质复杂，C18可吸附脂肪、脂类和矿物质等，PSA可吸附酚类、糖类和色素等，选择200 mg C18+50 mg PSA净化材料后可消除大部分杂峰，同时可以得到较好的回收水平和净化提取效果，整个提取净化过程不到1 h。

　　2.5线性方程、检出限、定量限

　　将氯羟吡啶和二硝托胺储备液稀释成质量浓度均为0.025、0.05、0.1、1.0、10.0μg/mL和50.0μg/mL的混合标准工作液，进行HPLC分析。以目标分析物峰面积（A）对浓度（C，μg/mL）绘制标准曲线，氯羟吡啶的线性方程为A=68 116C－4 652，相关系数R2=0.999 8；二硝托胺的线性方程为A=66 708C+3 361.4，相关系数R2=1.000 0。

　　在鸡蛋空白样品中添加氯羟吡啶和二硝托胺混合标准溶液，按上述1.3方法处理后经HPLC检测，以响应值的3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限，氯羟吡啶和二硝托胺的检出限分别为0.025 mg/kg和0.050 mg/kg，定量限分别为0.075 mg/kg和0.100 mg/kg。

　　2.6样品回收率及精密度

　　在鸡蛋空白样品中进行氯羟吡啶和二硝托胺添加量均为0.1、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg的加标回收试验，每个水平平行测定6次，计算回收率及相对标准偏差。氯羟吡啶的回收率范围为87.70%～101.78%，RSD范围为0.66%～5.41%；二硝托胺的回收率范围为84.99%～97.11%，RSD范围为0.95%～5.34%。表明该方法重复性良好，可满足实际检测的需要。

　　3结论

　　本研究通过对检测波长、提取剂和净化剂等条件进行优化，建立一种MSPD-HPLC检测鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺药物残留的方法。该方法操作简单，检测效率高，试验成本低，具有优异的线性范围、灵敏度和精密度，适用于大批样品的快速检测，可为鸡蛋中氯羟吡啶和二硝托胺药物残留监测提供可靠的技术支持。

       参考文献：

　　[1]庞李艳，钟名琴，吴雯娟，等．结合PRiME HLB净化快速测定动物源性食品中二硝托胺残留的超高效液相色谱—串联质谱法[J]．饲料博览，2020（4）：1-4，8.

　　[2]GB 31650—2019，食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量[S].

　　[3]栾庆祥，黄鑫，孙鹃，等．超高效液相色谱法测定鸡肉中氯羟吡啶和磺胺类药物残留的方法研究[J]．中国家禽，2018，40（11）：33-36.

　　[4]黄梅英，王华珍，卢军，等．应用QuEChERS-HPLC/MS/MS法测定鸡蛋中的氯羟吡啶和阿维菌素[J]．浙江农业科学，2020，61（9）：1 872-1 875.

　　[5]陈树兵，刘忠义，李露青，等．气相色谱—串联质谱法快速测定鸡肉组织中氯羟吡啶残留量[J]．分析测试学报，2017，36（5）：689-692.