摘要：炎性因子在非洲猪瘟病毒（ASFV）致非洲猪瘟（ASF）的发病机制中发挥着重要作用，该病毒引发高度传染性且严重的出血性疾病。在本研究中ASFV的I10L蛋白可能是TNF-α和IL-1β触发的NF-κB信号通路的潜在抑制剂。在HEK293T和PK-15细胞中，异位表达的pI10L显著抑制了NF-κB信号的激活。缺乏I10L基因的ASFV突变体（ASFVΔI10L）在初代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中诱导了比其亲本ASFV HLJ/2018株（ASFVWT）更高水平的炎症因子产生。该研究阐明了pI10L的免疫抑制活性，并为深入了解ASFV病理生物学以及开发针对ASF的疫苗提供参考。

　　关键词：非洲猪瘟病毒；炎症反应；I10L蛋白；IKKβ

　　African Swine Fever Virus I10L Protein Inhibits NF-κB Signaling Pathway by Targeting

　　IKKβ

　　LIAO Jinyan1，XU Licong1，HUANG Lifei2，LONG Chunbei3

　　（1.Animal Disease Prevention and Control Center of Longzhou County，Chongzuo City，Guangxi，Chongzuo Guangxi 532400，China；2.Guangxi Chongzuo Animal Disease Prevention and Control Center，Chongzuo Guangxi 532200，

　　China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Tiandeng County，Chongzuo City，Guangxi，Chongzuo

　　Guangxi 532800，China）

　　Abstract：In the pathogenesis of African Swine Fever（ASF）caused by the African Swine Fever Virus（ASFV），inflammatory factors play a crucial role，leading to a highly contagious and severe hemorrhagic disease．In this study，the I10L protein of ASFV is identified as a potential inhibitor of the NF-κB signaling pathway triggered by TNF-αand IL-1β.Ectopically expressed pI10L significantly inhibits the activation of the NF-κB signaling pathway in HEK293T and PK-15 cells．The ASFV mutant lacking the I10L gene（ASFVΔI10L）induces higher levels of inflammatory factors in primary porcine alveolar macrophages（PAMs）compared to its parental ASFV HLJ/2018 strain（ASFVWT）．This study elucidates the immunomodulatory activity of pI10L and provides insights for a deeper understanding of ASFV pathobiology and the development of vaccines against ASF.

　　Keywords：African Swine Fever Virus，inflammatory response，I10L protein，IKKβ

　　0引言

　　非洲猪瘟是一种高度传染的猪类疾病，死亡率接近100%，严重影响猪的商业饲养。非洲猪瘟病毒是一种多层次的双链DNA（dsDNA）病毒，与其他大型核质DNA病毒共享结构、基因组和复制特征[1]。ASFV编码了超过160种蛋白质，使其能够在体内成功感染、复制和免疫逃逸[2]。ASFV主要靶向初级巨噬细胞和单核细胞，导致分泌前炎症细胞因子的增加，如肿瘤坏死因子α（TNF-α)、白细胞介素-1β（IL-1β)、IL-6和IL-8[3]。由于其具有促炎、促凋亡和促凝血特性，升高的TNF-α水平在ASF的发病机制中起着重要作用[4]。迄今为止，对非洲猪瘟病毒的病理生物学和免疫逃逸机制了解不足，导致市场上缺乏安全有效的疫苗或抗病毒策略。本研究旨在揭示ASFV编码的I10L蛋白在TNF-α/IL-1β触发的NF-κB信号通路中的关键作用，为深入了解ASFV的发病机制提供新的见解，为开发针对ASF的疫苗提供帮助。

　　1材料与方法

　　1.1质粒构建

　　表达HA-、Flag-或His标签的pI10L、TRADD、MYD88、TAK1、TAB1、TAB2、TAB3、IKKα、IKKβ、NEMO、IκBα、p65、p50及其突变体的质粒采用标准的分子生物学技术构建。使用携带HA标签的pI10L或其截短突变体的稳定细胞系，采用lentivirus介导的基因编辑技术建立。HEK293T细胞转染了包装质粒psPAX2和pMD2.0G、重组质粒或空载体pLOV。36～48 h后，收集含假病毒的培养上清液，加入感染PK-15细胞。用帕培霉素筛选感染的细胞，以建立稳定的细胞系，引物见表1。

　　1.2 RT-qPCR

　　使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用HiScript III 1st Strand cDNA合成试剂盒按照制造商的方案进行逆转录到cDNA。采用HiScript II Q RT SuperMix按照制造商的方案进行三重复合，显示的数据是相对于GAPDH的那些mRNA的相对丰度。RT-qPCR所用的引物序列见表2。

　　1.3免疫共沉淀和免疫印迹分析

　　转染携带表达指示蛋白的质粒的细胞用M2裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂，并超声处理2 min。裂解液在4℃离心10 min，以13 000 g离心。上清液用鼠抗Flag MAbs、兔抗HA、抗Myc、抗IKKβ或抗NF-κB p65 MAbs，或兔抗NF-κB1或抗IKKγPAbs，或抗Flag M2磁珠免疫沉淀。然后用冷M2裂解液洗涤珠子3次。通过SDS-PAGE分离结合蛋白，然后进行免疫印迹分析。

　　1.4统计分析

　　使用GraphPad Prism和SPSS Statistics进行统计分析。直方图中的定量数据以“平均值±标准差”表示。使用Log-rank（Mantel-Cox）检验或不配对的Student's t检验对数据进行分析。*的数量表示与P值相关的显著性程度，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

　　2结果与分析

　　2.1 ASFV pI10L抑制TNF-α和IL-1β引发的NF-κB信号通路激活

　　为识别与病毒诱导的炎症反应相关的候选分子，在报告基因试验中对179个ASFV蛋白进行了筛选，以确定其调节TNF-α引发的NF-κB信号激活的能力。将pNF-κB-Fluc（0.1μg）、pRL-TK（0.01μg）和表达不同ASFV蛋白的质粒（0.2μg）转染入HEK293T细胞中。20 h后，细胞用TNF-α（10 ng/mL）处理10 h，然后进行荧光素酶测定。通过筛选，鉴定出了ASFV pI10L（图1A）。HEK293T细胞转染pNF-κB-Fluc（0.1µg）、pRL-TK（0.01µg）和不同剂量的pI10L表达质粒。细胞处理和测定方式如图1A所述。在HEK293T细胞中的进一步试验表明，pI10L以剂量依赖的方式抑制了TNF-α和IL-1β引发的NF-κB启动子的激活（图1B）。为研究pI10L是否参与内源性NF-κB信号的调节，测定在pI10L表达的HEK293T细胞中经过TNF-α和IL-1β处理后多种促炎细胞因子的转录水平。HEK293T细胞转染pI10L或空载体（Vec）质粒，随后用TNF-α（10 ng/mL）和IL-1β（10 ng/mL）处理。经过RT-qPCR分析检测CCL20、IL-8和TNF-α基因的mRNA水平。外源表达的pI10L显著抑制了TNF-α和IL-1β诱导的CCL20、IL-8和TNF-α基因的mRNA转录水平（图1C）。HEK293T细胞转染pI10L或Vec质粒，然后用TNF-α（10 ng/mL）和IL-1β（10 ng/mL）处理。经过免疫印迹分析检测IκBα和p65的磷酸化水平。与空载体转染的细胞相比，TNF-α和IL-1β诱导的IκBα和p65的磷酸化，这是下游信号组分激活的标志，显著在表达pI10L的HEK293T细胞中被抑制（图1D）。这些结果表明，pI10L参与调节由TNF-α和IL-1β引发的促炎细胞因子的表达。

　　2.2 ASFV I10L蛋白调节IKKβ与IκBα和p65的激活和相互作用

　　IKKβ是磷酸化IκBα和p65的主要激酶，而IKKβ的磷酸化在IKK复合物激活中起着核心作用。HEK293T细胞转染pRK（Vec）或pFlag-pI10L质粒。细胞随后用TNF-α（20 ng/mL）处理5、10、20 min或40 min，然后进行免疫印迹分析。使用ImageJ软件进行蛋白表达水平的密度分析。本研究表明，pI10L的外源表达显著阻止了TNF-α引发的IKKβ的磷酸化（图2A）。已经报道，IKK复合物的调节亚单位NEMO可以被TRAF6和TRAF2/5泛素化，而这种K63链多泛素化对于激活IKKβ至关重要。为了确定pI10L如何调节IKKβ的激活，检测了NEMO的K63链泛素化（Ub）。HEK293T细胞转染表达HA-K63O、Myc-NEMO或Flag-pI10L的质粒，随后进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。免疫印迹分析显示，在pI10L存在的情况下，NEMO的Ub-K63链连接减少了（图2B）。HEK293T细胞转染表达HA-K63O、Myc-NEMO或Flag-pI10L的质粒，随后进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。PAMs未感染或感染ASFVWT或ASFVΔI10L（MOI=3）24 h后，细胞被处理或不处理TNF-α（20 ng/mL）20 min，随后进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。使用ImageJ软件进行蛋白表达水平的密度分析。与亲代病毒ASFVWT相比，ASFVΔI10L感染在TNF-α处理时一致且显著增强了IKKβ的磷酸化水平（图2C）和NEMO的K63链泛素化（图2D）。这表明pI10L通过减少NEMO的K63链泛素化抑制了IKKβ的磷酸化。已经显示IKK复合物的组装对于IKKβ的激活至关重要。研究结果表明，pI10L通过调节NEMO的K63链多泛素化来抑制IKKβ的激活。此外，pI10L与IKKβ相关，从而抑制其对IκBα和p65的激酶活性，从而抑制NF-κB信号通路的激活。

　　3讨论

　　先天免疫反应是宿主对病毒感染的首要防线，是在宿主细胞通过感知病毒结构成分（称为病原相关分子模式，PAMPs）的保守途径识别后启动的[5]。PRRs在感染后通过感知病毒PAMPs激活一系列信号事件，导致下游抗病毒效应蛋白（包括I型干扰素和促炎细胞因子）的表达[6]。ASFV是一种巨大、复杂的DNA病毒，编码了160多种在成功感染中所需的蛋白质，从而在体内实现复制和免疫逃逸。ASFV感染会激活抗病毒信号通路，增加干扰素刺激基因和促炎细胞因子的表达水平，尤其是NF-κB信号通路[7]。然而，ASFV免疫逃逸的机制仍然不清楚。本研究中，ASFV pI10L作为在病毒感染和TNF-α或IL-1β处理后抑制病毒诱导的炎症反应的抑制剂。在HEK293T细胞中转染I10L能显著抑制NF-κB启动子的活化、促炎细胞因子的转录以及由TNF-α或IL-1β引起的IκBα和p65的磷酸化。

　　在稳定表达pI10L的PK-15细胞中，表明pI10L在不同细胞类型中在ASFV的免疫逃逸中发挥重要作用。考虑到pI10L对TNF-α和IL-1β引发的NF-κB信号通路的无偏效应，假设pI10L在TAK1-TABs复合物的水平或下游发挥作用。pI10L抑制了p65以及NF-κB信号通路中p65上游的所有被测试蛋白的活化。此外，发现pI10L与IKKβ、NEMO和NF-κB有关联。有几种可能的机制解释pI10L的功能。首先，pI10L通过干扰IKKβ复合物的组装或NEMO的多泛素化来抑制IKKβ的激活。其次，pI10L可能抑制p65与p50的结合。最后，pI10L可能阻断p65的激活和核转运。结果表明，pI10L通过调节NEMO的K63-泛素化来抑制IKKβ的磷酸化，同时通过与IKKβ相互作用减弱其对IκBα和p65的催化活性。然而，pI10L对NF-κB或IKK复合物的组装仅有轻微干扰。IκBα和p65在TNF-α和IL-1β引发的NF-κB信号通路中被IKKβ磷酸化[8]。因此，在体外进行了激酶活性分析。结果证实IKKβ能够磷酸化IκBα和p65，但pI10L显著抑制了这一过程，因为pI10L中断了IκBα和p65与IKKβ的结合。pI10L通过与IKKβ直接结合、阻碍其催化中心或与IκBα和p65竞争作为底物来抑制IKKβ的激酶活性。

　　此外，通过使用I10L基因删除的ASFV，探讨了pI10L对促炎细胞因子表达的影响。结果显示，pI10L在PAMs中轻微影响了ASFV的溶血吸附和复制。然而，与ASFVWT相比，ASFVΔI10L引起了NF-κB信号通路的更强烈激活。到目前为止，已经鉴定了几种其他调节NF-κB激活的ASFV编码蛋白，如pL83L、pMGF505-7R和H240R蛋白（pH240R）[9]。缺乏这些基因的ASFV导致各种促炎细胞因子表达减少和病毒复制增加，而这些调节蛋白之间的关系尚不清楚。单一基因缺失几乎不影响ASFV的毒力（除了pMGF505-7R和pH240R），这可能是因为这些蛋白在病毒感染和发病的不同阶段共同发挥作用。例如，这些蛋白可能在病毒感染的不同阶段参与炎症反应。为了加快对ASF的有效疫苗的研发，需要进一步深入研究这些蛋白如何共同发挥作用。

　　4结束语

　　pI10L通过靶向IKKβ在调节TNF-α和IL-1β引发的NF-κB信号通路中发挥了关键作用。由于炎症反应在ASF的发病机制和宿主抗病毒先天免疫中起着重要作用，因此pI10L的发现有助于阐明ASFV复杂的免疫逃逸机制，并可能为发现用于开发新型ASF疫苗或抗病毒药物的潜在靶点提供线索。

参考文献

　　[1]Shao Z，Su S，Yang J，et al．Structures and implications of the C962R protein of African swine fever virus[J]．Nucleic Acids Res，2023，51（17）：9 475-9 490.

　　[2]Malogolovkin A，Kolbasov D．Genetic and antigenic diversity of African swine fever virus[J]．Virus Res，2019，271：197 673.

　　[3]Zakaryan H，Cholakyans V，Simonyan L，et al．A study of lymphoid organs and serum proinflammatory cytokines in pigs infected with African swine fever virus genotype II[J]．Arch Virol，2015，160（6）：1 407-1 414.

　　[4]Zheng Y，Li S，Li S H，et al．Transcriptome profiling in swine macrophages infected with African swine fever virus at single-cell resolution[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2022，119（19）：e2 201 288 119.

　　[5]Hu M M，Shu H B．Innate Immune Response to Cytoplasmic DNA：Mechanisms and Diseases[J]．Annu Rev Immunol，2020，38：79-98.

　　[6]Yang Q，Shu H B．Deciphering the pathways to antiviral innate immunity and inflammation[J]．Adv Immunol，2020，145：1-36.

　　[7]Cackett G，Portugal R，Matelska D，et al．African Swine Fever Virus and Host Response：Transcriptome Profiling of the Georgia 2007/1 Strain and Porcine Macrophages[J]．J Virol，2022，96（5）：e0 193 921.

　　[8]Schoggins J W，MacDuffD A，Imanaka N，et al．Corrigendum：Pan-viral specificity of IFN-induced genes reveals new roles for cGAS in innate immunity[J]．Nature，2015，525（7 567）：144.

　　[9]Li D，Yang W，Li L，et al．African Swine Fever Virus MGF-505-7R Negatively Regulates cGAS-STING-Mediated Signaling Pathway[J]．J Immunol，2021，206（8）：1 844-1 857.