摘  要：试验旨在研究运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）鼓风干燥保护剂的添加。本试验以细菌 总数和活菌数为指标，采用固态培养基培养运动发酵单胞菌，然后用鼓风干燥的方式对运动发酵单 胞菌进行干燥处理，最后使用25%葡萄糖培养基进行发酵，以失重方式评估其活性。结果显示，培 养的细菌数达到 1.85×1010  CFU/g。用固态培养基等质量的乳糖+5%的甘露糖、+2%或+4%的甘油作 为组合保护剂，在 39 ℃鼓风干燥过程中细菌数达到 1.31×1010  CFU/g 和 1.2×1010  CFU/g，且存活率 超过 94%。干燥前后的失重结果基本一致，表明鼓风干燥后的细菌具有较高活性。

　　关键词：运动发酵单胞菌；细菌数；存活率

　　运动发酵单胞菌是一种高效的乙醇生产菌株， 有许多理想的工业生物催化剂特性[1] 。它的代谢途径已得到广泛研究，有助于揭示其高乙醇生产率和耐受性的机制。

　　目前，微生物的干燥方法通常包括冷冻干燥、喷 雾干燥和真空干燥[2]。相比其他干燥方法，鼓风干燥 操作简单，可显著降低成本，同时能达到预期的干燥 效果[3] 。有研究发现，糖作为干燥保护剂能起到脱水 保护的作用，并且不含原基，不会使蛋白质发生褐变 反应从而变质失活，甘油可以清除自由基及活性氧， 这有助于防止变性和其他形式的损坏[4]。

　　本研究以运动发酵单胞菌为研究对象，采用固 态培养基培养运动发酵单胞菌，使用显微镜计数法 统计细菌数量，利用鼓风干燥法处理细菌，通过添加 可能的保护剂分析其对细菌存活率的影响，最后采 用发酵方式分析鼓风干燥运动发酵单胞菌的可行性。

　　1   材料与方法

　　1.1   材料与试剂

　　1.1.1    菌株

　　运动发酵单胞菌由湖北工业大学汪浩勇老师实验室提供。

　　1.1.2   原料

　　豆粕和麸皮均购自河北油脂有限公司，含水率 分别为 11.3%和 11.8%。

　　1.1.3   培养基

　　固态培养基：豆粕 7 g，麸皮 3 g，混合后 121 ℃ 灭菌 20 min。

　　ZM 液态培养基：25%葡萄糖，1%酵母提取物， 0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，pH  6.0～7.0，115 ℃灭菌 30 min。

　　ZM 活化培养基：10%葡萄糖，1%酵母提取物， 0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，pH  6.0～7.0，115 ℃灭菌 30 min。

　　1.2   仪器与设备

　　SPX-250-B 型生化培养箱，上海福码公司；LS- 335L-I 型高压蒸汽灭菌锅 ，江阴宾江医疗有限公 司；PH50-3A43L 型显微镜 ，苏州光学神鹰有限公 司；101-2B 型电热鼓风干燥箱，恒诺利兴科技有限 公司；DHS-10A 型电子水分测定仪，邦西仪器科技 有限公司；CJ-2D 型超净工作台，天津泰斯特。

　　1.3   试验方法

　　1.3.1   运动发酵单胞菌的固态培养

　　使用豆粕作为原料提供细菌生长所需的营养， 麸皮作为辅料改善培养基的通透性。豆粕与麸皮质 量比为 7 ∶3 的混合原料 10 g，5%的活化菌液混在 无菌水溶液（含有 0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二 钾，0.1%硫酸铵，5%葡萄糖）中，取 10 g 加到混合原 料中混匀，在 33 ℃恒温培养箱中培养 24 h，使用显 微镜观察并统计细菌数。

　　1.3.2   鼓风干燥及保护剂添加

　　分别用灭菌的淀粉、乳糖和麦芽糖与培养的运 动发酵单胞菌固态培养基等质量混合。固态培养基 和保护剂各称取 4 g（培养基是湿重，含有 50.39%的 水分），混匀后放在 39 ℃电热鼓风干燥箱风吹，直至 含水率低于 10%。

　　1.3.3   组合保护剂的选择

　　培养运动发酵单胞菌的固态培养基与乳糖等质 量混匀后，分别添加固态培养基质量分数 2%，4%， 6%，8%的甘油到其中，另一组分别添加固态培养基 质量分数 5%，10%，15%，20%的甘露糖，混匀后放 在 39 ℃电热鼓风干燥箱风吹 ，直至含水率低于 10%。

　　1.3.4   发酵试验

　　经过鼓风干燥的菌株用无菌水悬浮起来，以 5%的接种量加入葡萄糖发酵培养基，瓶口用活塞塞 紧，并添加石蜡油密封，第一次称重并记录，发酵瓶 置于恒温摇床中超过 72 h。结束后进行第二次称 重。

　　1.3.5   细菌总数及活菌数的确定

　　运动发酵单胞菌培养结束后，加水约 45 g 将细 菌悬浮起来，取 50 μL 悬液，将其加到有 950 μL 无 菌水的 EP 管中混匀，取 10 μL 于血球计数板，用显 微镜拍照计数。

　　鼓风干燥结束后，加入大约 45 g 水将细菌悬浮 起来，混匀后取 10 μL 加到含有 30 μL 水的八连管 中，取 10 μL 亚甲基蓝溶液加入其中进行染色，染 色时间大约 1 min ，取 10 μL 染色液于血球计数板 上，用显微镜拍照统计细菌总数和活细菌数。其中 在显微镜下观察到蓝色的细菌为死细菌，颜色没有 变化的是活细菌。细菌数/g=N×256×5 000×稀释倍数 （N 为显微镜下观察到的细菌数）

　　2   结果与分析

　　2.1   运动发酵单胞菌固态培养

　　以豆粕 7 g 和麸皮 3 g 混合作为固态培养基， 5%的运动发酵单胞菌与无菌水（含有 0.1%七水硫 酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，5%葡萄糖）混 匀后取 10 g 加入固态培养基中，在 33 ℃下培养 24  h。在显微镜下观察到的形态如图 1 所示，运动发酵 单胞菌在显微镜下呈圆形、无色透明状态，经统计计 算得出细菌数达到 1.85×1010  CFU/g。表明在此条件 下能够培养出足够多的细菌。

　　2.2   鼓风干燥的主要保护剂选择

　　运动发酵单胞菌培养 24 h 后，淀粉、麦芽糖、乳 糖作为保护剂与培养细菌的固态培养基 1 ∶ 1 混匀， 以不添加任何保护剂的培养基作为对照组，然后放 在 39 ℃电热鼓风干燥箱中风吹干燥，直到含水量低 于 10% 。麦芽糖和乳糖经过稀释后，可以在显微镜 下清楚地观察到细菌，可以作为保护剂与固态培养 基 1 ∶ 1 混匀进行鼓风干燥。麦芽糖和乳糖作为保护 剂进行热风干燥后 ，细菌总数和活菌数分别为 1.38 ×1010   CFU/g、7.27 ×109  CFU/g，1.05 ×1010  CFU/g、 9.07×109  CFU/g。其对应的存活率分别为 52.49%和 86.34%。对照组总细菌数为 7.35×109  CFU/g，活菌数 只有 2.79×109  CFU/g，存活率为 37.91% 。虽然添加 麦芽糖后，细菌总数达到最高，但其保护效果不明  显，而添加乳糖后，存活率明显比对照组和添加麦芽  糖的高，且细菌总数也比对照组有明显增加。因此， 选择乳糖作为鼓风干燥的主要保护剂。

　　2.3   组合保护剂选择

　　固态培养基等质量的乳糖分别与 5% ，10% ， 15%，20%的甘露糖为组合保护剂。当添加 5%的甘 露糖后，细菌总数达到 1.26×1010  CFU/g，活菌数也高 达 1.19×1010  CFU/g，细菌数显著比对照组多，其存活率超过 94% 。进一步增加其添加量，细菌总数明显 减少。表明在鼓风干燥过程中，添加 5%的甘露糖能 有效地增加细菌数，提高细菌存活率。

　　固态培养基等质量的乳糖分别与 2%，4%，6%， 8%的甘油作为组合保护剂。添加 2%和 4%的甘油 后进行鼓风干燥，细菌总数分别达到 1.38×1010  CFU/  g 和 1.26×1010  CFU/g ，而活菌数也分别高达 1.31 ×  1010  CFU/g 和 1.2×1010  CFU/g，细菌总数明显比对照 组多，存活率超过 94%。在鼓风干燥过程中，添加一 定量的甘油能有效地使细菌从固形物中脱离下来， 从而能在显微镜中观察到更多的细菌。当甘油的添 加量增加时，细菌数有所减少，过多的甘油添加量也 会减少细菌数量。鼓风干燥过程中，2%～4%的甘油 添加不仅能有效地提高细菌总数，还能提高细菌干 燥存活率。

　　2.4   发酵试验

　　鼓风干燥结束后，用无菌水将运动发酵单胞菌 悬浮起来，吸取 1 mL 接种于 25%的葡萄糖发酵培 养基中，培养基质量为 30 g，用电子天平称整个发 酵瓶的质量，在 34 ℃下培养 72 h，结束后再称其质 量，计算其失重。结果如表 1 所示，干燥后的失重值 为 0.100 1 g/g，与没有干燥菌株的失重结果非常接 近，表明鼓风干燥方式可用于运动发酵单胞菌的干燥。

　　3   结论

　　在 5%接菌量、5%葡萄糖浓添加量、加水量 10  g、33 ℃ 条件下培养时间 24 h ，获得的细菌数为 1.85×1010  CFU/g。在 39 ℃下进行鼓风干燥，固态培 养基等质量的乳糖与 5%的甘露糖作为组合保护 剂，活菌数达到 1.19×1010  CFU/g，存活率超过 94%， 对鼓风干燥有明显的保护效果。固态培养基等质量 的乳糖分别与 2%或 4%的甘油作为组合保护剂，活 菌数分别达到 1.31×1010  CFU/g 和 1.2×1010   CFU/g， 存活率超过 94%。干燥前后的菌株都具有较好的发 酵能力。

　　参  考  文  献

　　［1］ 邹少兰, 张鲲, 井欣, 等. 运动发酵单胞菌 ZM4、CP4 菌 株基因工程选择标记的研究［J］. 工业微生物, 2012, 42(3): 72-77.

　　［2］ 蔡文静. 喷雾干燥法制备副干酪乳杆菌微胶囊及其体外功能验证［D］. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2022.

　　［3］ 赵甜宇, 潘朝阳, 张朝辉, 等. 固态枯草芽孢杆菌菌剂的 制备工艺研究［J］. 食品工业科技, 2020, 41(19): 104-111, 120.

　　［4］ 毕雨星, 张香美, 卢涵, 等. 肉类发酵菌种真空冷冻干燥 保护剂研究进展［J］. 肉类工业, 2021(6): 47-50.