摘  要：铜绿假单胞菌是一种不允许在饮用水中检出的条件致病菌，本文对 10 株分离自饮用水样 品的菌株进行了菌落形态观察及生化反应确证，并使用 HK-MID 细菌鉴定系统、VITEK 2 全自动 微生物鉴定系统和 16S rRNA 基因测序等多种手段进行进一步鉴定。鉴定结果表明，部分菌株并非 铜绿假单胞菌，但均为条件致病菌，从食品安全的角度考虑，不应出现在饮用水、矿泉水中。本文除 了探讨以往的研究普遍关注的检验方法的准确性与时效性，还对这些菌株进行了分析，为相关管理 部门进行质量监督、制定标准提供了研究依据和借鉴。

　　关键词：铜绿假单胞菌；HK-MID 细菌生化鉴定系统；VITEK 2 全自动微生物鉴定系统；16S rRNA 基因测序

　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿 脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属于专性需氧非发酵菌 类假单胞菌属，广泛分布于自然界的水、土壤、空气 中，存在于人和动物的皮肤、肌体、呼吸道和消化道 中。当该菌在特定条件下的数量超过人体正常的稳 态调节范围时，会引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症 和皮肤炎症等疾病，是一种常见的条件致病菌。鉴 于铜绿假单胞菌的致病性 ，我国饮用水标准 GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》和饮 用矿泉水标准 GB 8537-2018《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》对铜绿假单胞菌的限量为每 250 mL 水样中铜绿假单胞菌不得检出。

　　目前对饮用水中铜绿假单胞菌的检测，主要使 用 GB 8538-2022《食品安全国家标准 饮用天然矿 泉水检验方法》[1]  中的滤膜法（以下简称 GB 8538- 2022 法），即观察 CN 琼脂平板上生长的可疑菌落 的形态并对其进行生化反应确证，确认该平板上是 否存在铜绿假单胞菌阳性菌株。除此之外，一些行 业检测标准及研究中还兼用其他检验方法[2-4]来确 认菌株是否为铜绿假单胞菌。其中，细菌生化鉴定系统是常见的菌株鉴定手段，其中常用的鉴定系统 包括 HK -MID 细 菌 生化 鉴 定 系 统 和 VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统[5]。与按细菌生化反 应来鉴定其种属的检验方法相比，基因测序更为准 确[6]。而在以基因测序的方法鉴定铜绿假单胞菌的 研究中，除了选择某段特定基因序列设计的引物进 行特异性扩增后再测序外[7]，16S rRNA 基因测序也 被广泛运用[8-9]。在以往应用细菌生化鉴定系统和基 因测序等众多手段检测铜绿假单胞菌的研究中，大 多数研究的重点在于检验方法的准确性与时效性， 便于选择更准确、高效的方法来鉴别目标菌株，但对 GB 8538-2022 方法在 CN 琼脂平板上分离出的非 铜绿假单胞菌的细菌没有过多深入研究。本研究对 采用 GB 8538-2022 法在 CN 琼脂平板上生长的 10 株可疑菌落的菌株进行了检测，同时采用 HK-MID 细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生 物鉴定系统和 16S rRNA 基因测序进行了进一步的 鉴定研究，最终以 16S rRNA 基因测序的结果作为 判定依据，来确认菌株的种属。

　　1  材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试验用菌株

　　标准菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌CICC21630，均购自中国工业微生物菌种保藏中心；样品菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10均来自饮用水样品，用GB8538-2022法将其从CN琼脂平板上分离，目前保藏于国家食品监督检验中心微生物实验室。

　　1.1.2培养基及试剂

　　CN琼脂假单胞菌琼脂基础培养基、绿脓菌素测定用培养基、营养琼脂、乙酰胺肉汤、钠氏试剂、氧化酶试剂，均购自北京陆桥技术股份有限公司；十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺琼脂、SCDLP液体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；16SrRNA基因通用引I物27F（5”-A-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5”TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’由华大基因合成；PCR扩增及凝胶电泳所用试剂，均购自北京全式金生物技术有限公司。

　　1.1.3仪器及耗材

　　WFH-203B三用紫外分析仪产自上海驰唐电子有限公司；HK-MID细菌生化鉴定系统：配GNA+B革兰氏阴性杆菌鉴定条产自广东环凯生物科技有限公司；VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统：配套革兰氏阴性细菌鉴定卡（VITEK2GN卡）以及生理盐水和一次性透明塑料试管均产自法国梅里埃公司；DensiCHEKplus比浊仪产自法国梅里埃公司；BioDropuLite超微量核酸蛋白测定仪产自英国柏点公司；TProfessionalTrioPCR仪产自德国耶章分析仪器股份公司；JY300C电泳仪及电泳槽产自北京君意东方电泳设备有限公司；QUANTUM-ST5全自动凝胶成像系统产自北京五洲东方科技发展有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1菌株的活化

　　将实验室保藏的标准菌株及样品菌株，分别划线接种于假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂、十六烷三甲基溴化铵琼脂和乙酰胺琼脂三种不同的培养基平板上，36°℃培养48h。

　　1.2.2菌落形态观察

　　观察三种培养基上的菌落形态，必要时将其置于紫外线下观察，判断菌落是否存在荧光。对于三种培养基上生长的疑似菌落，按照GB8538-2022法进行生化反应确证试验。

　　1.2.3生化反应确证试验

　　产氨试验：将CN琼脂上发荧光、非蓝色且非绿色的菌落，或不发荧光、红褐色菌落纯培养物接种到乙酰胺液体培养基中，接种乙酰胺肉汤，36°℃培养24h后滴加1~2滴钠氏试剂，10s内检查试管的颜色变化，若表现出从黄色到转红色的颜色变化，则结果为阳性，否则为阴性。42°℃生长试验：将CN琼脂上发荧光、非蓝色且非绿色菌落的纯培养物接种到营养琼脂平板上，42°C培养48h，能生长的为阳性结果，否则为阴性。

　　1.2.4HK-MID细菌生化鉴定系统

　　氧化酶试验：取2^3滴氧化酶试剂于无菌平血为的洁净滤纸上，用一次性塑料接菌环挑取培养物涂抹在滤纸上，10s内显示为深蓝紫色的为阳性反应。GNA+B革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行鉴定：挑取单菌落至营养琼脂平板上，划线分离，36°℃培养24h后，自营养琼脂平板上挑取1个新鲜菌落至5mL无菌0.85%的氯化钠溶液中，混合均匀。将制得的菌悬液滴加至GNA+B的鉴定试剂条上，36C培养48h后观察并记录相关反应，在MicrogenID软件上读取鉴定结果。

　　1.2.5VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统

　　将菌液滴加至 HK-MID 细菌生化鉴定系统的同时，再从36°℃培养24h的营养琼脂平板上挑取单菌落，放入含有3mL0.9%氯化钠溶液的一次性透明塑料试管中，制成浊度为0.48~0.61的均匀菌悬液。将试管放置在VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统的载卡架上，将VITEK2GN卡导管插入菌悬液中。按VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统的操作说明书，对测菌悬液进行充填、装载，并在VITEK2Systems软件中进行设定，次日观察鉴定结果。

　　1.2.616SrRNA基因测序

　　自营养琼脂平板上挑取1个新鲜菌落至SCDLP 液体培养基中，36 ℃培养至培养基浑浊。按 照细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明书上的操作步 骤，提取标准菌株和样品菌株的 DNA。在确认 DNA 纯度和浓度均符合 PCR 扩增要求后 ，使用 16S rRNA 基因通用引物 27F 和 1492R 对菌株的 DNA 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为： 引物 27F 和 1492R 各 1 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，High Pure dNTP （2.5mM）2 μL，Bovine Serum Albumin 0.3 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL， DNA 模板 2 μL，DNase/RNase-free Deionized water 16 μL，合计总体积 25 μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，该流程共循环 30 次；最后 72 ℃延 伸 10 min。扩增完成后，用凝胶电泳检测扩增产物， 并将具有 16S rRNA 基因片段的目的条带送至华大 基因进行基因测序。

　　2  结果与分析

　　2.1  标准菌株及样品菌株的菌落形态及初 步生化反应确证试验结果

　　目前标准方法中铜绿假单胞菌的选择性培养基 主要为 CN 琼脂[1,10]、十六烷三甲基溴化铵琼脂[11-12]和 乙酰胺琼脂[11]，如果样品菌株仅能在 CN 琼脂上生 长，而不能在十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺琼脂培养基上生长，则表明 CN 琼脂的选择性较差。对 10 个样品菌株及作为阳性对照的 2 个铜绿假单胞 菌标准菌株的菌落形态进行观察及初步生化确证试 验的结果见表 1。

　　由表 1 可知，2 个标准菌株和 10 个样品菌株均 能在三种培养基上生长，说明本试验中 CN 琼脂培 养基的选择性较好。其中只有 2 个标准菌株和样品 菌株 9、10 的菌落形态符合 GB 8538-2022 法中铜 绿假单胞菌的特征形态，结合产氨试验和 42 ℃生长 试验结果，可判定样品菌株 9、10 为铜绿假单胞菌， 样品菌株 1~8 中的疑似菌落为非铜绿假单胞菌。

　　2.2  标准菌株及样品菌株氧化酶试验结果

　　按 HK-MID 细菌生化鉴定系统说明书的要求， 首先对待测菌株进行氧化酶试验以确定使用鉴定试 剂条的种类。10 个样品菌株及 2 个标准菌株的氧化 酶试验结果见表 1。由表 1 可知，10 个样品菌株及 2 个标准菌株的氧化酶试验结果均为阳性，因此选择 GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行后续鉴 定。

　　2.3  标准菌株及样品菌株的PCR 产物凝胶电泳结果

　　为了知晓 PCR 产物是否含有目的基因片段，需 要先对其进行凝胶电泳测定，10 个样品菌株及 2 个 标准菌株的 PCR 产物凝胶电泳结果见图 1。

　　由图 1 可知，样品菌株 1~10 及 2 个标准菌株 的 PCR 产物在 1 500 bp 处均有清晰明亮的条带，证 明已成功扩增出了可用于测序的 16S rRNA 基因片 段，可进行下一步的基因测序。

　　2.4  标准菌株及样品菌株的HK-MID 细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系 统及 16S rRNA 基因测序的鉴定结果对比

　　为了确认 10 个样品菌株的种属，运用 HK-MID 细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生 物鉴定系统及 16S rRNA 基因测序三种不同的微生 物鉴定方法，对样品菌株进行检测，并以标准菌株 ATCC 27853 和 CICC 21630 为阳性对照。结果见表 2。

　　由表 2 可知，经过上述三种鉴定方法的检测，标 准菌株 ATCC 27853、CICC 21630 和样品菌株 9、10 均被判定为铜绿假单胞菌，且可能性都在 90%以 上，结果与 GB 8538-2022 法的判定结果一致。说明 三种鉴定方法均可用于鉴定饮用水中的铜绿假单胞 菌。

　　然而以 16S rRNA 基因测序结果作为最终判定 依据进行比较后发现，HK-MID 细菌生化鉴定系统 将样品菌株 1、4~8 共六株菌均被误判为莫拉氏菌属（Moraxella.spp）。同时 ，将属于恶臭假单胞菌 （Pseudomonas putida）的样品菌株 2、3 误判为铜绿 假单胞菌。造成该现象的原因推测为：广东环凯生 物科技有限公司提供的《HK-MID 革兰氏阴性杆菌 生化鉴定系统使用说明书》的数据表中，没有代尔夫 特 菌 属 （Delftia） 和 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 （Stenotrophomonas maltophilia）的相关数据，导致样 品菌株 1、4~8 被误判为莫拉氏菌属。

　　与 HK-MID 细菌生化鉴定系统相比，梅里埃公 司的VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统不仅 可明确将食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans）、嗜 麦芽窄食单胞菌与莫拉氏菌属区分开，还正确鉴定 出了样品菌株 2、3 为恶臭假单胞菌。对于样品菌株 1，VITEK 2 Compact 的鉴定结果为食酸代尔夫特菌 （Delftia acidovorans），而 16S rRNA 基因测序的结果 显示该菌种为 Delftia sp. WY8、Delftia lacustris 和 Delftia tsuruhatensis，虽然菌种不同，但均为代尔夫 特菌属细菌。可见，VITEK 2 Compact 全自动微生物 鉴定系统的检测范围更加广泛，鉴定结果也更精准。 

　　2.5  标准菌株及样品菌株的系统发育树

　　为了更直观地表达上述细菌之间的亲缘关系， 首先将 2 个标准菌株和 10 个样品菌株用 16S rDNA 的测序结果在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对，得 出了具体的所属菌种。并采用 MEGA 软件绘制系统 发育树呈现其结果，见图 2。

　　从图 2 可以看出，同属铜绿假单胞菌（Pseu- domonas aeruginosa）的标准菌株 ATCC 27853、CICC 21630 和样 品菌株 9、10，与同属恶臭假单胞菌 （Pseudomonas putida）的样品菌株 2、3 的亲缘关系最近，与同属嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的样品菌株 4~8 的亲缘关系次之，而与 代尔夫特菌属（Delftia）样品菌株 1 的亲缘关系最 远。

　　3  结论与讨论

　　从研究结果可知，由于 HK-MID 细菌生化鉴定 系统中的 GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定条的生化反 应孔数量较少、判定信息不足、数据库细菌种类不够 全面等，导致该系统的误判几率很大，而 VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统包含更多详细的生 化反应信息和精密仪器，其鉴定结果更加精确，可用 来进行最终的菌株判定。同时，VITEK 2 Compact 全 自动微生物鉴定系统及 16S rRNA 基因测序均可以 对疑似菌株进行精确鉴定。

　　值得注意的是，这些疑似铜绿假单胞菌的菌株 中包含食酸代尔夫特菌、恶臭假单胞菌和嗜麦芽窄 食单胞菌等细菌。其中，食酸代尔夫特菌可能会使免 疫力低下的病患产生伤口感染及多种炎症[13]；恶臭 假单胞菌也是条件致病菌[7]，且发生过医院感染的 情况[14]；嗜麦芽窄食单胞菌也会引起多种炎症与感 染[15-19]，其中最常见的是血液和呼吸道感染[20-23]，这 两种感染的发病率和死亡率较高[24-25]。因此，出于对 消费者健康和公共卫生安全的考虑，在包装饮用水、 矿泉水乃至水源水中，除了铜绿假单胞菌之外，其他 条件致病菌（如代尔夫特菌属、恶臭假单胞菌、嗜麦 芽窄食单胞菌等）也应当受到重视，相关部门适当监 督并控制这些细菌的造成污染非常有必要。

　　参  考  文  献

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