摘  要：利用等温滴定量热法研究镉离子与鸟嘌呤核糖核苷酸（GMP）的亲合过程，重点分析不同比 例的镉离子和 GMP 结合时的异同，实验结果显示：（1）镉离子和 GMP 的浓度比不同会对二者的结 合过程产生显著影响，在低浓度比下，反应为焓驱动的放热反应；在高浓度比下，反应为吸热反应。 从镉离子和 GMP 浓度比为 20 ∶ 1 时的ITC 滴定曲线和 OneSite 模型拟合结果可知，镉离子和 GMP 是接近并按照 1 ∶ 1 的比例结合的，二者的亲合力 K 值为 1.21E 4±2.26E 3。（2）推测 GMP 与镉离子 有两个结合位点，一个为放热结合位点，一个为吸热结合位点，在低浓度比下，只有放热结合位点发 生结合。当浓度比到达一定值后，会激活吸热结合位点，同时发生吸热结合和放热结合。因为吸热结 合位点的结合能力更强，最终可能呈现为吸热反应。（3）通过反滴法和正滴法的比较，同一浓度下， 不同的滴加方式也会对结合结果造成较大的影响。该研究所采用的方法可以很好地从宏观的热力 学角度分析金属镉离子与GMP 的亲合机理，以期为后续镉离子印迹物制备过程中功能单体的筛选 提供重要的试验基础和理论指导。

　　关键词：等温滴定量热法；镉离子；功能单体

　　镉离子作为一种对人体危害性极大的重金属离 子，是一种世界公认的严重污染物，并且很多产品都 设立了对镉含量的限值[1-2]。目前已有的检测手段， 都需要经历较为复杂的前处理过程，将镉离子富集 和分离[3-5]。而离子印迹技术作为一种重要的重金属 检测技术已逐渐被运用于很多关键领域，离子印迹 技术一般以离子为模板，通过静电作用和配位作用 等手段与功能单体结合，形成螯合物，之后以酸性试 剂为洗脱剂，将模板离子从螯合物上洗脱[6-8]。最终 制备出具有与目标金属离子相对应的三维孔穴结构 的离子印迹聚合物[9]。现如今，离子印迹技术已逐渐 被应用于食品，分析化学，工业废水治理等领域[10-11]。

　　但值得注意的是，离子印迹检测技术仍需要进 一步完善，其主要问题在于金属离子半径过小，且各种金属离子结构相近，导致目前常用的功能单体都 无法做到将特异性与模板离子的特异性相结合 [12- 13]。基于此。本研究的主要目标就是探究重金属镉离 子和功能单体鸟嘌呤核糖核苷酸（GMP）的结合机 理，为筛选出可以与镉离子的特异性结合的优秀功 能单体提供理论基础和实验基础。

　　研究中采用等温滴定量热法研究二者的亲合机 理。等温滴定量热法（ITC）是一种直接测量双分子反 应过程中热量释放或消耗的物理技术，是一种在恒 定温度下配体与大分子接触的分析方法[14-15]。它根 据热力学的基本原理工作，两个分子之间的接触会 导致热量产生还是吸收，往往取决于结合的类型，即 放热或吸热[16-17]。通过对 ITC 结果进行分析，可以定 量测定分子结合过程中的化学计量比（N）、亲合常数（K）、焓变(ΔH）和熵变(ΔS）等参数[14]。获取的这些 参数将为研究镉离子与单体的亲合机理提供直接的 热力学数据支撑。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与试剂

　　氯化镉、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）及氢氧 化钠均购自国药基团化学试剂有限公司；鸟嘌呤核 糖核苷酸（GMP）购自上海宝曼生物科技有限公司。

　　1.2  仪器与设备

　　等温滴定量热仪（ITC200）（美国马尔文仪器有 限公司）；Heraeus TMFresco TM17 离心机（美国贝克 曼库尔特有限公司）；Brand 普兰德单道可调移液器 （德国普兰德 Brand 有限公司）；磁力搅拌器（IKA）、 pH 计（梅特勒托利多）。

　　1.3  实验步骤

　　（1）溶液配制：用 pH 7.5 的 HEPES 缓冲溶液按 实验所需配制不同浓度的氯化镉和 GMP 溶液。

　　（2）溶液脱气：因为等温量热滴定法测量的是微 量反应热，溶液中含有气泡会使实验结果存在较大 的误差。为了预防产生误差，在实验开始前，需要对 溶液进行离心，这样不仅可以使溶液体系均匀，还可 以去除其中的气泡。在配制完溶液后，将其放入离 心机中，在 25 ℃的条件下，离心 5 min。

　　（3）样品池加样：使用专用进样针抽取离心管中 的样品，在抽取过程中要尽量保证进样针内无气泡 进入，抽取之量大概为样针的三分之二。抽取完毕 后，将进样针插入样品池中，缓慢匀速地将样品推入 样品池中，直到样品与样品池等高。之后用针筒的 针头缓慢搅动样品池，排出样品池中的气泡。

　　（4）滴定注射器加样：在样品进样完毕之后，将 装有滴定物的 PCR 管放到仪器的对应孔中，仪器就 会自动抽取一定体积的滴定物。在仪器抽取完滴定 物之后，需确认滴定注射器内是否含有气泡，如果 有，则需操作仪器重新取样，直到滴定注射器中没有 气泡。

　　（5）进行等温量热滴定实验：在滴定物装载完毕 后，将滴定物注射器插入样品池中，按照提前设定好 的滴数和相关参数将滴定物加入样品池中，用滴定 物注射器进行搅拌，使滴定物和被滴定物充分结合。

　　（6）数据处理：将通过 ITC 得到的热反应曲线导 入 ITC200 配套的 original 软件中，通过软件计算得 出反应热曲线的各项数值，结合常数 K，化学计量比 N，焓变 ΔH，熵变 ΔS。

　　1.4  试验设计

　　本研究选用的缓冲液为非离子缓冲液 HEPES。 非离子型缓冲液可以减少实验过程中缓冲背景对电 导率测试的干扰。为了研究 GMP 与镉离子的作用机 理，实验分别选取四种比例浓度的 GMP 和镉离子进 行反应，分别为：5 ∶ 1、8 ∶ 1、10 ∶ 1 和 20 ∶ 1，即将 5、8、10、20 mmol/L 的氯化镉分成 20 滴逐滴加到 1 mmol/L 中的 GMP 中。其中探针中氯化镉的总体积 为 40 μL，除了第一滴为 0.4 μL 外，其他 19 滴都为 2 μL，GMP 的体积为 210 μL。

　　此外，还需进行背景滴定实验。分别用 5、8、10、 20 mmol/L 的氯化镉滴定实验所用 的缓 冲溶液 HEPES，使最终结果扣除背景的影响。背景扣除也是 采用 ITC200 配套的 original 软件进行的。

　　2  结果与讨论

　　2.1  不同比例的镉离子与 GMP 的等温滴定量热 研究

　　2.1.1  镉离子和 GMP 浓度比为 5 ∶ 1 时的 ITC 实验 研究

　　图 1 是镉离子和 GMP 浓度比为 5 ∶ 1 时的 ITC 滴定曲线和 OneSite 模型拟合结果，图中上半部分 的两条曲线分别为镉离子滴加到缓冲液中所产生的 背景热量和镉离子与GMP 结合产生的热量变化曲 线。两条曲线本来都是以纵坐标 0 为基线的，但为了 方便比较，都将背景热量向上平移了 4 个单位，之后 的几组数据也采用了同样的处理方式。在整个实验 过程中，一共向 GMP 中滴加了 20 滴镉液，除了第一 滴镉液是用来确定基线的，之后每一个峰都代表着 一滴镉液滴加到 GMP 中所产生的热量变化。在这个 浓度比中，每个反应峰都在基线以下，说明电源代偿 的功率为负值，参比池的温度低于样品池，由此得知 此过程为放热反应。而终点的峰并未返回基线，说明 在这个浓度比中，GMP 未全部与镉离子结合。

　　图 1 的下半部分，是将图 1 上半部分两条热量 变化曲线的每个峰值相减，再积分求它们的面积，最后得到 19 个数值，拟合出来的就是下边的曲线，它 反映了整个结合过程中的热量变化。图的纵坐标为 反应的热量，横坐标为摩尔比率，在该反应过程中， 曲线斜率变化不大，说明该反应是以一种较为均匀 的速度进行的。右边方框里的四个数值分别为结合 常数 K，化学计量比 N，焓变量 ΔH，熵变量 ΔS。N 值 反应了镉离子与 GMP 的反应比例，K 值反应了镉离 子与 GMP 结合的性能。在此反应中 K 值大约为 1.51E 3，说明其结合性能并不理想。焓变值 ΔH 和 熵变值 ΔS 分别代表整个反应过程中的热量变化和 体系混乱程度的变化，在此浓度中，ΔH<0，ΔS>0，根 据吉布斯函数公式 ΔG=ΔH-TΔS，ΔG<0，说明该反应 是一个以焓变为主要驱动力的自发反应，可以在任 何条件下自发进行。

　　2.1.2  镉离子和 GMP 浓度比为 8 ∶ 1 时的ITC 实验 研究

　　图 2 是镉离子和 GMP 浓度比为 8 ∶ 1 时 ITC 滴 定曲线和 OneSite 模型的拟合结果，从上半部分的 两张图可以看出，比值为 5 ∶ 1 时，该浓度下热量变 化曲线的最后几个峰已经接近基线了，但还没有完从图下半部分的曲线可以看出，一开始斜率较 大，之后慢慢趋于平缓，进入了一个平台期。而右边 的图框显示 N 值变小了，这是由于镉离子的浓度变 高，其化学计量比下降了。而 K 值增加（8.92E 3），说 明在该浓度下，镉离子与 GMP 的结合更加稳定了。 同时表明，该反应也是一个以焓变为主要驱动力的 自发反应。

　　2.1.3  镉离子和 GMP 浓度比为 10 ∶ 1 时的 ITC 实 验研究

　　图 3 是镉离子与 GMP 的浓度比为 10 ∶ 1 时 ITC 滴定曲线和 OneSite 模型的拟合结果，该图相较 于上述两个浓度的 ITC 曲线明显不同。从上半部分 的图可以明显看出整个反应从放热反应变为了吸热 反应。但在第一个吸热峰之后存在一个小的放热峰， 所以推测可能同时存在吸热和放热两种反应。

　　从图的下半部分来看，曲线的构型与前两个浓 度正好相反，说明在该浓度下，而者的结合反应发生 了变化。而从图中的拟合参数可知，N 值高达 1.89， 几乎是前两个浓度的 N 值的两倍，说明镉和 GMP 的结合比例大约为 2 ∶ 1。该浓度比例下，K 值是前 两个浓度的 10 倍，但 K 值的误差也较大，为 6.01E 4±1.50E 5，说明该比例下的拟合结果不理想。

　　2.1.4  镉离子和 GMP 浓度比为 20 ∶ 1 时的 ITC 实 验研究

　　图 4 是镉离子和 GMP 的浓度比为 20 ∶ 1 时 ITC 滴定曲线和 OneSite 模型的拟合结果。从图中上 半部分的滴定曲线可知，镉离子与 GMP 的结合延续 了 10 ∶ 1 的浓度比，一开始为吸热反应，且反应迅 速；第 6 滴之后，滴定曲线显示，二者的结合过程从 吸热反应变成了放热反应；且在第 9 滴之后反应趋 于稳定，基本与滴定的背景结果值一致。

　　从图 3 下半部分的模型拟合结果可知，N 值为 0.998，说明镉离子与 GMP 是接近并按照 1 ∶ 1 的比 例结合的。该比例下拟合得到的 K 值为 1.21E 4± 2.26E 3，拟合误差小，结果较为理想。

　　2.2  不同比例镉离子和GMP 反应的热力学拟合 结果分析

　　表 1 的结果显示了不同比例的镉离子与 GMP 反应的各个热力学参数，通过比较四组数据，研究发 现当体系中镉离子浓度较低、GMP 浓度较高时，反 应为放热反应。反应化学计量比也在 1 以下，说明 此时大分子 GMP 与镉应该只有 1 个结合位点，这个 结合位点与镉离子结合会产生放热反应。但当体系中镉离子浓度升高且 GMP 浓度降低到一定比例时， 反应就会变成吸热反应，同时 N 值也会突然升高到   1.89，此时镉离子与 GMP 的化学计量比将近 2 ∶ 1， 即一个 GMP 结合两个镉离子，说明此时 GMP 与镉   离子可能存在两个结合位点。在其他人研究中也出   现了类似的情况，周洁和王延华等[18]在用 ITC 研究   Zn 离子和血清蛋白的结合机制时，发现在反应浓度   较低时，只发生放热反应，但当浓度升高到一定比例   时，会同时出现吸热和放热反应。他们推断血清蛋白   和 Zn 离子有吸热和放热两种结合位点，在浓度较   低时，只有放热结合位点会发生反应，而当浓度升高   到一个适当的比例时，放热反应产生的热会“激活” 吸热位点，同时发生吸热和放热结合。

　　从热力学的角度进行分析，在 5 ∶ 1 和 8 ∶ 1 时， ΔH<0，ΔS>0，根据吉布斯函数，该反应在任何情况下 都可以自发进行，而到 10 ∶ 1 和 20 ∶ 1 时，ΔH>0， ΔS>0，该反应只有温度 T 大于一定程度才会自发发 生。而分析下图的纵坐标得知，起始热量会随浓度上 升而越来越高，说明初始温度上升，会使吸热结合位 点自发发生反应。

　　因此，我们推测在本实验中 GMP 和镉也可能同时含有吸热和放热两个结合位点，但在浓度较低 时，只有放热结合位点发生结合，N 值小于 1。但当 浓度到达一个适合的比例时，GMP 的另一个吸热结 合位点就会被激活，此时溶液会同时发生吸热和放 热两种结合，且由于吸热位点的结合能力较放热位 点强很多（K 值较大），反应以吸热为主，这也可以解 释结合常数 K 在反应变为吸热反应后突然上升的 现象。而当反应体系中镉离子的浓度进一步升高 时，镉离子只与结合能力强的吸热位点结合，N 值又 回到了 1 以下。当然此结论都是基于 GMP 有吸热 和发热两种结合位点的假设，具体结论还有待研 究。

　　2.3  反滴法研究镉离子与 GMP 的结合机理

　　为了进一步研究镉离子与 GMP 的结合机理，我 们采用反滴法，以 GMP 为滴定物，镉离子为被滴物， 选择 1 ∶ 10 的浓度比进行试验。滴定和拟合结果如 图 5 和表 2 所示。

　　不同于正滴法，再 10 ∶ 1 的浓度下，二者的结 合过程依然是放热反应，且反应速度很快，8 滴之后 反应基本就结束了。其热力学参数与正滴法中的放 热反应相似，结合常数 K 为 6.05E 3±2.38E 3，介于 正滴法的 5 ∶2 和 8 ∶ 1 之间。焓变 ΔH<0，熵变 ΔS> 0，ΔG<0，得知该过程也是一个以焓变力为主要驱动 力的自发反应。因为是反滴法，此时的化学计量数 与正滴法互为倒数，换算成正滴法应为 2.3，说明此 时可能已经出现两个结合位点，但吸热结合位点的 活度不够，整体反应还是以放热为主。但反应的焓 变相较于前两种浓度已经降低了很多，且反应的后半段已经出现了吸热小峰。该体系很可能正处于放 热反应和吸热反应的交界点附近。总体而言，在同样 的浓度比下，反滴法的结果与正滴法存在很大的差 距，说明反应样品的加入顺序对整个反应有显著影 响。

　　3  结论

　　离子印迹技术作为一种特异性检测和重金属离 子去除技术，目前所面临的主要难点在于其对功能 单体的选择，常用的几种分子印迹聚合物都无法很 好地与重金属离子的特异性结合，而国内外关于相 关功能单体的研究仍主要集中于单体性能，缺乏对结合机理的深入探究。本文通过研究镉离子与 GMP 的结合机理，希望可以为之后功能单体的选择研究 提供一些帮助。

　　从研究中得出的主要结论如下：镉离子和 GMP 的浓度比不同会对二者的结合过程产生显著影响， 在低浓度比下，反应为焓驱动的放热反应；在高浓度 比下，反应为吸热反应。根据数据推测 GMP 与镉离 子存在两个结合位点，一个为放热结合位点，一个为 吸热结合位点，在低浓度比下，只有放热结合位点发 生结合，浓度比达到一定值时，才会激活吸热结合位 点，同时发生吸热和放热结合。而且因为吸热结合 位点的结合能力更强，反应可能呈现为吸热反应。 通过反滴法与正滴法的比较，发现在同一浓度下，不 同的滴加方式和滴加顺序也会对结合结果造成较大 的影响。

　　ITC 法作为一种热力学分析方法，可以从得到 的热力学参数来解释物质之间亲合力的强弱，是研 究物质之间相互作用的黄金标准。本文的研究结果 将为筛选可以与镉离子结合的优秀功能单体提供一 定的理论数据支撑和实验指导。

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