摘要：针对溶剂浸提法从万寿菊中提取叶黄素时工艺流程复杂、提取率低的问题，提出了一种新的超临界流体联合提取法。首先，使用超临界二氧化碳萃取技术对万寿菊进行处理。然后，再用三氯甲烷、乙醇混合液进行浸提处理。并对提取流程、叶黄素标准储备液制备和气相色谱－质谱联用仪检测方法等进行分析。结果表明，采用超临界流体联合提取法能够将万寿菊中叶黄素的提取率从16.2 mg/g提升到29.4 mg/g，大幅提升了叶黄素的提取经济性，具有重要的应用价值。

　　关键词：万寿菊；叶黄素；溶剂浸提；超临界二氧化碳萃取

　　0引言

　　万寿菊中叶黄素是一种重要的中药成分，在提高免疫力、促进神经发育等方面具有十分重要的作用。由于叶黄素的特殊性，目前，其合成较为困难，主要是通过溶剂浸提的方法从万寿菊中提取。但是，在实际应用中发现，采用溶剂浸提法提取叶黄素率，提取率仅为16.2 mg/g，无法满足日益增长的制药需求。

　　国内外学者对叶黄素提取技术进行了大量研究，徐兰程[1]提出了超临界二氧化碳萃取技术，简化了提取流程，但实际提取率不足10％，无法满足工业生产需求。郑倩倩等[2]提出了超声波提取技术，但实际提取率更低，也难以进行工业性应用。

　　本文以超临界二氧化碳萃取技术和溶剂浸提法为基础，提出了一种超临界流体联合提取法，并设计实验方案、分析方法进行实验验证。

　　1实验方案设计

　　1.1实验材料及设备

　　实验材料：万寿菊、纯度超过99.99％的CO2气体、乙醇、丙酮、三氯甲烷、叶黄素标准液和蒸馏水。

　　实验设备：SFE-500超临界流体萃取机、GC-MS6800型气相色谱－质谱联用仪、UV-3200S型分光光度计和精度为0.001g的JA2103N型精密电子秤。

　　1.2实验方法设计

　　1.2.1叶黄素标准曲线测定方法

　　先取2.5 mg的叶黄素标准液加入到容量瓶中，取乙醇定容到25 mL，制备成质量浓度为100μg/mL的叶黄素标准液，在阴凉环境下储存。

　　取配置好的质量浓度为100μg/mL的叶黄素标准液，将其分为体积为60、120、180、240、300、360、420、600μL的8组。然后，加入乙醇进行稀释，分别制备成质量浓度为2、4、6、8、10、12、14、20μg/mL的标准测试液。利用UV-3200S型分光光度计在240~500 nm波长范围内每隔1 nm测试一次标准测试液的吸光度，绘制吸光度标准曲线，从而可以精确地确定出叶黄素的最大吸收波长[3]。

　　1.2.2超临界流体联合提取方法

　　取4 g万寿菊粉末，按文献［4］方法[4]，在温度为45℃、压力为22.6 MPa和流量为30 g/min的情况下，利用二氧化碳萃取技术萃取20 min。然后，将万寿菊粉末过滤出来，用蒸馏水清洗干净。

　　按文献［5］方法[5]，将萃取过的万寿菊粉末用三氯甲烷、乙醇混合液（三氯甲烷与乙醇的体积比为3∶2）在温度为45℃的工况下提取3 h。用UV-3200S型分光光度计检测萃取液中的叶黄素质量分数，从而确定超临界流体联合提取法对叶黄素的实际提取率。

　　在用分光光度计进行检测时，其参数直接影响测试结果。为了保证测试的准确性，对UV-3200S型分光光度计的最佳工作参数进行分析，并将进样口的温度设置为255℃,先升温到80℃,保温60 s。然后，按5℃/min的升温速率升高到190℃,保温180 s。再按15℃/min的升温速率升高到300℃,保温300 s。氦气流量为1.2 mL/min。

　　1.2.3叶黄素实际提取率计算方法

　　叶黄素的实际提取率可按公式（1）表示为：

　　y=nρV/m1.（1）

　　式中：y为叶黄素的提取率，％；n为萃取液的稀释倍数；ρ为用分光光度计测定的叶黄素质量浓度，μg/mL；V为萃取液的定容体积，mL；m1为万寿菊粉末质量，g。

　　2实验结果分析

　　2.1叶黄素标准曲线测定

　　利用UV-3200S型分光光度计按叶黄素标准曲线测定方法进行测定，得出叶黄素的最大吸收波长为450 nm。然后，将叶黄素质量浓度作为横坐标，叶黄素在450 nm处的吸光度作为纵坐标，绘制叶黄素标准曲线。叶黄素的标准曲线可表示为y=0.077 91x+0.00146，该标准曲线的相关系数为0.999 5，如图1所示。

　　2.2超临界流体联合提取法提取叶黄素

　　2.2.1超临界二氧化碳萃取要点

　　超临界二氧化碳萃取时，需要利用夹带剂提高萃取效果。目前，常用的夹带剂主要是丙酮和乙醇[6]。为了确定不同夹带剂对萃取效果的影响，进行了对比实验验证，结果如表1所示。

　　由表1可知，在不同夹带剂情况下，挥发油的颜色和黏稠度呈现明显的区别。使用丙酮为夹带剂情况下的颜色最浅，挥发油黏度最小、挥发油中物质的种类最少。使用乙醇做夹带剂的情况下，颜色最深，挥发油黏度最大、挥发油中物质的种类最多。

　　在采用丙酮做夹带剂情况下，叶黄素提取率为3.56 mg/g。在没有夹带剂情况下，叶黄素的提取率为6.33 mg/g。在使用乙醇做夹带剂的情况下，叶黄素的提取率为7.92 mg/g。由此可知，采用乙醇为夹带剂能够提升叶黄素的提取率。因此，在联合提取法中，使用超临界二氧化碳萃取时，应将乙醇作为夹带剂来提高处理效果。

　　2.2.2联合提取法提取结果

　　以萃取过的万寿菊粉末为原料，取三氯甲烷、乙醇混合液（体积比为3∶2）为提取溶剂，根据超临界流体联合提取方法进行叶黄素的提取。然后，利用UV-3200S型分光光度计在450 nm处检测叶黄素的质量分数。最后，再按照叶黄素实际提取率计算方法进行计算。在此提取方法下叶黄素的提取率为29.4 mg/g，叶黄素提取率有了大幅提升。

　　2.2.3叶黄素提取率增加原因分析

　　为了深入研究在采用联合提取法情况下叶黄素提取率大幅提升的原因，对采用不同处理方法后的万寿菊粉末特性进行研究，结果如图2所示。

　　由图2可知，在经过二氧化碳萃取以后，万寿菊粉末的微观结构发生了明显破坏。进一步经过三氯甲烷、乙醇混合液的作用后，万寿菊粉末的微观结构破碎度进一步增加，其内部的纤维组织暴露出来，使内部的叶黄素和其他组分能够更方便地被提取出来，进而提高了万寿菊粉末中叶黄素的提取率。

　　3结论

　　针对溶剂浸提法从万寿菊中提取叶黄素提取率低的问题，提出了一种超临界流体联合提取法，通过二氧化碳萃取和溶剂浸提相结合，提升了万寿菊内部纤维组织的暴露程度，进而提高了叶黄素的提取率。实验验证表明：

　　1）使用超临界二氧化碳萃取时，应将乙醇作为夹带剂，从而提升对万寿菊的处理效果。

　　2）先使用超临界二氧化碳萃取技术对万寿菊进行处理，然后再利用三氯甲烷、乙醇混合液（体积比为3∶2）进行浸提处理，能够破坏万寿菊粉末的微观结构，从而使叶黄素能够更方便地被提取出来。

　　3）联合提取技术能够将叶黄素提取率提高到29.4 mg/g，极大地提升了叶黄素的工业应用经济性。

参考文献

　　[1]徐兰程，杨胜坤，王陈琴，等.万寿菊的生物活性及其在动物生产中的应用研究[J].饲料研究，2022，45（2）：141-144.

　　[2]郑倩倩，王小芳，路丽娟，等.蚕沙中叶黄素和β-胡萝卜素的含量测定及提取条件优化[J].食品与药品，2022，24（2）：127-132.

　　[3]罗维巍，李双，刁全平，等.响应面法优化超声提取酸浆宿萼中叶黄素的工艺及抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂，2022，33（1）：62-68.

　　[4]吴红艳，石岩，李秀鑫，等.大孔树脂纯化万寿菊花中叶黄素的工艺优化[J].食品与机械，2022，38（9）：153-158.

　　[5]侯艳梅，吴桐，谢奎.叶黄素生物活性功能的研究进展[J].中国食物与营养，2021，27（11）：51-57.

　　[6]赵永平，钟娇娇，朱亚，等.超临界CO2法萃取万寿菊中叶黄素的工艺优化研究[J].陕西农业科学，2016，62（12）：70-72.