摘要：文章以乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）制备的非载药微球为模型，研究PLGA微球的缓释机理，以筛选出能反映体内降解行为的体外释放方法。同时，建立凝胶渗透色谱（GPC）方法，用于测定非载药PLGA微球的分子量并验证其效果，通过体外降解研究非载药微球在降解过程中的动态变化，结合差示扫描量热仪（DSC）和扫描电子显微镜（SEM）等辅助表征手段全面考察其降解特性。文章考察了非载药PLGA与体内相近降解周期的体外释放条件，有助于缩短辅料筛选周期，为载药微球的体外释放研究提供科学依据。

　　关键词：生物可降解材料；缓释微球；聚乳酸-羟基乙酸共聚物

　　微球技术通过将药物嵌入生物可降解材料中的微小颗粒，显著提升小分子、蛋白质及多肽药物的生物利用率与半衰期。乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为核心载体材料，具有良好的生物相容性和可控降解性，在癌症、精神疾病等临床领域展现出了广阔的应用前景。然而，PLGA种类繁多，开发过程中需要精心筛选合适型号，并借助动物实验深入探究其体内降解特性[1-2]。

　　文章聚焦模拟市售多肽缓释微球常用的PLGA型号，采用复乳化-溶剂挥发法制备非载药微球，同时通过系统分析微球在不同温度与pH条件下的体外降解行为，并结合多种表征技术，致力于开发一种能精准反映体内降解过程的体外释放方法。

　　1材料

　　1.1仪器设备

　　高速剪切机（IKA®T18，德国IKA公司）；冷冻干燥机（VirTis advantage ES-53，P Industries Inc）；差示扫描量热仪（METTLER公司，瑞士）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；S-3400扫描电镜型场发射扫描电子显微镜（Hitachi公司，日本）。

　　1.2试剂和耗材

　　聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PDLG5002，分子量约20 kDa，Corbion）；PVA（KURARAY POVAL 22-88，醇解度87.0%~89.0%，日本KURARAY公司）；甘露醇（药用级，Merck）；二氯甲烷（色谱纯，TEDIA）；滤膜（Millex HV Nylon 0.45μm）。

　　2方法

　　2.1非载药PLGA微球制备方法[3]

　　称取1 g的PLGA（A∶GA=50∶50；Mw：20 kDa），溶于4 mL二氯甲烷中形成油相。向油相中加入1 mL蒸馏水，冰水浴条件下12 000 r/min高速剪切2 min，得到W/O初乳；将初乳注入40 mL 1%的PVA溶液中，8 000 r/min高速剪切3 min，得到W/O/W复乳；将复乳加入80 mL 3%的NaAc溶液中，常温搅拌2 h，水洗3次去除表面残留的乳化剂，离心（3 000 r/min，10 min）收集微球，加入适量甘露醇溶液（甘露醇占冻干后总重的10%~15%），冷冻干燥24 h，过孔径0.074~0.038 5 mm组合筛网，收集孔径0.074~0.0385 mm筛网中间截留的微球，即得非载药PLGA微球。

　　2.2分子量检测方法

　　2.2.1样品溶液配制

　　空白溶液：精准吸取0.5 mL二氯甲烷置于10 mL量瓶中，加四氢呋喃稀释至刻度，混匀，作为空白溶液。

　　标准溶液：分别取聚苯乙烯对照品A（含重均分子量约为100 000、20 000和1 000）、聚苯乙烯对照品B（含重均分子量约为700 000、50 000和3 000）、聚苯乙烯标准样品C（含重均分子量约为300 000和7 000）各分子量约10 mg，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL二氯甲烷振摇溶解，再加四氢呋喃稀释至刻度，分别制成各分子量质量浓度为1 mg/mL的溶液，作为标准溶液A、B和C。

　　供试品溶液：取非载药微球约150 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL二氯甲烷充分振摇溶解，加四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，用滤膜过滤，弃去初始续滤液5滴，取剩余续滤液作为供试品溶液。

　　专属性溶液：①甘露醇溶液：取甘露醇150 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL二氯甲烷充分振摇溶解，加四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，用滤膜过滤，弃去初始续滤液5滴，取剩余续滤液作为甘露醇溶液。②聚乙烯醇（PVA）溶液：精准称取150 mgPVA聚乙烯醇置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL二氯甲烷充分振摇溶解，加四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，用滤膜（Millex HV Nylon 0.45μm）过滤，弃去初始续滤液5滴，取剩余续滤液作为PVA聚乙烯醇溶液。

　　2.2.2 GPC测试条件

　　依据中华人民共和国药典2020年版四部通则0512检测方法进行测定。

　　检测器：示差折光检测器；色谱柱：Waters Styrage HR4（7.8×300 mm）-Waters Styrage HR4（7.8×300 mm）-Waters Styrage HR3（7.8×300 mm）串联；流动相：四氢呋喃；检测器温度：35℃;柱温：35℃;进样量：100μL；流速：1.0 mL/min；运行时间：60 min；采样速率：5点/s；样品盘温度：10±5℃。

　　2.2.3 GPC测试方法验证

　　考察系统适用性、线性、专属性、重复性、中间精密度和耐用性，以验证当前GPC测试条件是否满足供试品测试需求。

　　2.2.3.1系统适用性

　　分别取空白溶液和标准样品溶液，按照“2.2.2”项下的方法进行测定，记录并绘制色谱图。空白溶液图谱无明显基线漂移，在主峰位置无明显干扰峰；标准样品溶液除空白溶液峰，各峰的分离度均大于2.0。

　　线性：取标准曲线样品，以x为横坐标，y为纵坐标，将x与y进行线性回归。

　　方法：空白溶液、标准样品溶液每个进样1针，记录并绘制色谱图。

　　标准：采用GPC专用软件绘制标准曲线，相关系数（R）不小于0.998。同时，标准样品溶液各峰必须在V0~Vt。

　　2.2.3.2专属性

　　方法：空白溶液、标准样品溶液每个进样1针；甘露醇溶液、PVA聚乙烯醇和供试品溶液每个进样1针，记录并绘制色谱图。

　　标准：标准溶液中聚合体分子量峰的检测没有受到其他峰的影响，且与供试品溶液在同一位置出峰。

　　2.2.3.3重复性

　　方法：同一天由同一分析员测定空白溶液、标准样品溶液每个进样1针；供试品溶液6份，每份1针，记录并绘制色谱图。

　　标准：6份供试品溶液的重均分子量（Mw）的相对标准偏差（SRSD）不大于10.0%，保留时间（RT）的相对标准偏差（SRSD）不大于1.0%。

　　2.2.3.4中间精密度

　　方法：在不同日期，由2名测试人员使用不同仪器及色谱柱重复按照“重复性”项下方法进行操作。

　　标准：在满足系统适用性和线性要求的基础上，要求12份精密度（包括重复性与中间精密度）供试品溶液Mw的SRSD不大于10.0%，RT的SRSD不大于1.0%。

　　2.2.3.5耐用性

　　方法：各变动色谱条件下空白溶液、标准样品溶液和供试品溶液各进样1针，记录并绘制色谱图。

　　标准：各色谱条件下，在满足系统适用性和线性要求的基础上，将各变动条件下测定的结果与正常条件下测定的结果进行比较，Mw的SRSD不得大于10.0%（除改变流速条件外）；Mw回收率在90.0%~110.0%。

　　2.3体外降解条件考察方法

　　分别采用不同pH（4.5、7.4、10.0）和温度条件开展体外释放探索，观察非载药PLGA微球在不同释放条件（37、45℃)下0、1、3、7、14、21、35 d各时间点的分子量变化。

　　2.4 DSC检测方法

　　为防止甘露醇干扰检测，在测试DSC的样品冻干时未加入甘露醇。称取3~5 mg非载药微球置于铝制坩埚中，扎孔压片，升温范围控制在25~150℃,升温速率为10℃/min，在氮气环境下测定热量变化。

　　2.5扫描电镜检测方法

　　在体外释放过程中，分别取出体外释放条件下孵育0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、56 d、84 d的样品，以2 000 r/min的速度低速离心，10 min后去除上清液，用蒸馏水洗涤3次后冻干，置于双面胶带上涂布均匀，喷金后，通过扫描电镜观察微球表面形态。

　　3实验结果

　　3.1 GPC测试方法学验证结果

　　系统适用性：空白溶液图谱无明显基线漂移，在主峰位置无明显干扰峰；标准样品溶液各峰分离度R均满足要求。

　　线性：标准曲线R值为0.999，满足要求。

　　专属性：非载药微球保留时间为26.826 min，Mw为15 602 Da；PVA聚乙烯醇未出峰，甘露醇未出峰，满足要求。具体如图1所示。

　　重复性：同一实验员制备的6个平行样品的保留时间SRSD为0.1%，Mw（Da）SRSD为0.5%，满足要求。

　　中间精密度：不同实验员使用不同仪器和不同色谱柱在不同时间分别制备6个平行样品。12个样品的保留时间SRSD为0.3%，Mw（Da）SRSD为1.6%，满足要求。

　　耐用性：考察该方法在不同流速（0.8、1.2 mL/min）、不同柱温（30、40℃)、不同检测器温度（30、40℃)条件下的耐用性。保留时间、Mw（Da），以及Mw回收率的SRSD分别为0.5%、0.5%、0.6%，满足要求。

　　GPC方法学验证结果表明，该方法的系统适用性、线性、专属性、中间精密度、重复性和耐用性均满足供试品溶液检测需求。

　　3.2非载药微球DSC检测结果

　　非载药微球的相转变温度（Tg）约为31.92~49.28℃,同时体温在非载药微球相转变温度区间内。因此，在体内非载药微球处于玻璃态，而在体外其释放温度普遍为37℃和45℃[4]，非载药微球同样呈玻璃态。

　　3.3体外释放筛选结果

　　在35 d的体外释放过程中，观察到3组处于不同pH环境下的微球在37℃和45℃下的分子量降解存在差异。特别是在45℃、不同pH条件下的降解趋势相似，且均快于37℃、不同pH条件下的降解速度。进一步研究中，分别设定45℃,pH为7.4和10.0的条件开展为期3个月的体外释放考察。对比pH 7.4和pH 10.0介质中的非载药微球，发现两者在第28天的分子量降解均超过了90%。研究发现，碱性环境（pH 10.0）能显著加速微球降解，第3天降解了约40%，第7天便达到了82%。因此，选择45℃、pH 7.4作为优选的体外释放条件，并在此条件下观察各采样点非载药微球的扫描电镜形貌变化。具体结果如表2所示。

　　3.4体外释放过程中微球外观变化

　　利用扫描电镜观察非载药微球在45℃、pH 7.4条件下的形貌变化：开始时微球表面光滑，形态圆整；0~3 d外观无明显变化；第7天起表面出现孔道并逐渐扩大；第14天表面粗糙度显著提升，呈溶蚀状态；第21天时电镜下微球已不可见，转为碎片，聚合物形态发生显著改变。体外释放1个月后，样品仍为碎片且明显变薄变小；2个月后微球消失，仅见少量碎片。整体降解过程与分子量变化保持一致。具体如图3所示。

　　4讨论

　　文章通过分子量测试及DSC、扫描电镜等表征手段，研究了非载药聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的体外释放条件，旨在找到与体内相近的降解周期。

　　DSC结果显示，非载药微球在31.92~49.28℃温度范围内呈玻璃态。因此，选定该范围内的37℃和45℃作为研究条件。进一步研究发现，不同pH条件下微球分子量的下降程度各异，且微球在pH 7.4介质中的降解速率与本型号PLGA每月注射1次的给药频次相符。因此，最终选定45℃、pH 7.4作为体外释放条件。其分子量降解与文献报道[4]的降解周期基本一致。文章为药物开发提供了优先考察聚合物基质降解周期的体外条件，有助于筛选出符合给药周期的聚合物型号，缩短辅料筛选周期；同时也可用于载药微球的体外释放研究，指导药物开发过程中的处方筛选，减少体内药代研究次数。

参考文献

　　［1］张瑶.缓释微球制剂的研究进展［J］.医药导报,2004,23(11):843-844.

　　［2］Freiberg S,Zhu X X.Polymer microspheres for controlled drug release［J］.International Journal of Pharmaceutics,2004,282(1-2):1-18.

　　［3］QI P,BU R,ZHANG H,et al.Goserelin acetate loaded poloxamer hydrogel in PLGA microspheres:Core-shell di-depot intramuscular sustained release delivery system［J］.Molecular Pharmaceutics,2019,16(8):3502-3513.

　　［4］RAJESH K,J M P.Points to consider when establishing drug product specifications for parenteral microspheres［J］.The AAPS Journal,2010,12(1):27-32.