摘要：为提升保儿宁颗粒的质量标准，文章建立了保儿宁颗粒中黄芪、白术、防风的TLC法和测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总量的HPLC法，并建立了保儿宁颗粒的指纹图谱。保儿宁颗粒的TLC图呈现出各组分与相应对照和对照药材在同一位置的相同色斑，并显示阴性样品未受干扰；升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总量为1.7~2.0 mg/10 g。指纹图谱共标定了12个峰，并指认出了其中的3个色谱峰。文章建立的HPLC指纹图谱方法结果准确、稳定，可作为保儿宁颗粒的质量控制方法。

　　关键词：保儿宁颗粒；含量测定；指纹图谱；质量标准提升；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷

　　保儿宁颗粒具有益气固表、健中醒脾的功效[1]。其中，黄芪为方中君药，主要含三萜皂苷、黄酮类化合物及多糖。三萜皂苷以黄芪甲苷为主要成分[2]。白术中含有挥发油、内酯类、苷类、多糖、氨基酸和微量元素[2]。防风主要成分为升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷[3]。

　　保儿宁颗粒的原标准只有理化鉴别，没有含量测定，且在现有质量标准下，对其内在活性没有定量的质量控制要求。相关文献也仅涉及其所含的黄芪甲苷、升麻素苷的含量测定，而未见指纹图谱方面的研究成果。中药及其制剂成分复杂，仅凭单一成分评价质量过于片面，需要对保儿宁颗粒质量标准展开系统性研究。因此，文章将采用薄层色谱鉴别法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）对方中成分进行定性鉴别，并建立保儿宁颗粒的定性定量方法。实验共收集12批次的保儿宁颗粒样品，用以建立HPLC指纹图谱，并对指纹图谱展开分析，以期为系统、客观、科学评价保儿宁颗粒质量提供参考。

　　1仪器和材料

　　1.1仪器

　　LC-2030紫外-可见光检测器；LC-20AT液相色谱仪（岛津）；电子天平（梅特勒）。

　　1.2试药

　　对照药材均购自中国食品药品检定研究院，包括黄芪（120974-201612）、防风（120947-201409）、白术（120925-201611）。对照品中含有黄芪甲苷（110781-201717）、升麻素苷（111522-201712）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（111523-201610）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（111920-201606）、升麻素苷（111522-201913）。干燥粉及阴性对照：干燥粉（190901）、缺黄芪阴性（190904）、缺防风阴性（190905）、缺白术阴性（190906）、缺芦根阴性（190907）、缺鸡内金阴性（190908）、缺茯苓阴性（190909）、缺山药阴性（190910）。饮片：鸡内金（180702）、防风（180703）。乙腈（CNW）；磷酸（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；一级水（自制）。保儿宁颗粒共12个批次，均购自北京首儿药厂。

　　2方法与结果

　　2.1薄层鉴别

　　2.1.1黄芪鉴别

　　对照品溶液制备参照孙冬梅等[4]的方法。根据薄层色谱法（中华人民共和国药典2015年版通则0502）试验：选取硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，加热。结果显示，在365 nm的紫外光照射下，供试品与对照药材色谱图及对照药材色谱图的对应位置出现了同色荧光斑点，且对缺黄芪阴性色谱图无干扰（见图1A）。

　　2.1.2白术鉴别

　　同法制备白术对照药材溶液和缺白术阴性溶液。照薄层色谱法试验：选取硅胶GF254薄层板，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.06）溶液为展开剂。结果显示，在254 nm的紫外光照射下，供试品的色谱图与对照药材苍术的色谱图在对应位置出现了相同颜色的斑点，且对缺苍术的阴性色谱无干扰（见图1B）。

　　2.1.3防风鉴别

　　同法制备防风对照药材溶液和缺防风阴性溶液。用甲醇作溶剂制备1 mL/mg升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液。薄层点样展开方法同2.1.1。结果显示，供试品色谱与对照品色谱及对照品色谱在相应位置出现了同色斑点或荧光斑点，且对缺防风阴性色谱无干扰（见图1C）。

　　2.2制剂中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总量测定

　　2.2.1色谱条件

　　色谱柱：岛津InertSustain C18色谱柱（或等效色谱柱）；流动相A：乙腈，流动相B：水，梯度洗脱（0~49 min，13%→90%乙腈；49~52 min，90%乙腈；52~53 min，90%→13%乙腈；53~60 min，13%乙腈）；检测波长254 nm；柱温30~35℃。理论板数按升麻素苷峰计算应不低于2 000。

　　2.2.2对照品溶液的制备

　　精密称定升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，称取甲醇为溶剂制成每毫升含12μg升麻素苷、15μg 5-O-甲基维斯阿米醇苷的混合溶液。

　　2.2.3供试品溶液的制备

　　精密称定本品5 g置具塞锥形瓶中，加25 mL甲醇，密塞，称定重量，回流提取1.5 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀后滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

　　2.2.4阴性样品溶液的制备

　　精密称定缺防风阴性细粉0.5 g，同2.2.3项下方法制备。

　　2.2.5样品含量测定

　　将12批样品按2.2.3项下方制备供试品溶液，进样测定计算升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量。结果显示，总量为1.7~2.0 mg/10 g，符合规定。

　　2.3指纹图谱研究

　　2.3.1色谱条件

　　以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；岛津InertSustain C18色谱柱；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0~100 min，7%→60%乙腈；100~110 min，60%乙腈；110~111 min，60%→7%乙腈；111~120 min，7%乙腈）；检测波长215 nm；流速1.0 mL/min；柱温为35℃;进样20μL。

　　2.3.2对照品溶液的制备

　　精密称定3个对照品适量，用甲醇制成15μg/mL的对照品溶液。

　　2.3.3供试品溶液的制备

　　将保儿宁颗粒磨成粉后精密称定5 g置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称重，超声处理20 min，放冷，密塞，再称重，减失重量用50%甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

　　2.3.4指纹峰指认

　　同2.1项下方法操作，将对照品溶液与供试品的色谱图进行比对，指认相应的色谱峰，最终确认了3个峰，分别为升麻素苷（3）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（7）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（5）（见图2）。

　　2.3.5指纹峰归

　　将保儿宁颗粒和单味药浸膏按2.1项下方法进行操作，确定共有峰的归属。其中，1号峰为黄芪、防风、白术、山药的共有峰；10号峰为黄芪、防风的共有峰；3号峰为共有峰；5、9、11号峰为黄芪的特征峰；6、7号峰为防风的特征峰；12号峰为白术的特征峰；2、4号峰为芦根的特征峰；8号峰为鸡内金的特征峰。具体结果如图3所示。

　　2.3.6指纹图谱的建立

　　取12批保儿宁颗粒样品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定，得到保儿宁颗粒对照指纹图谱（见图4）和12批保儿宁颗粒HPLC指纹图谱叠加图谱（见图5），共确定12个共有峰。

　　3讨论

　　3.1定性鉴别方法的选择

　　实验对各现行标准薄层鉴别方法进行结果对比，发现各现行标准存在斑点Rf值过高、不清晰、专属性不强等问题。对此，结合文献[1-2，4]，对展开剂、提取方法等展开考察，并发现采用文章设计的方法可得到斑点清晰、分离度较好、专属性较强的结果。

　　3.2供试品溶液提取条件选择

　　在含量测定过程中考察了超声、加热回流等不同方法的提取效果。结果显示，加热回流提取效果最好。在指纹图谱研究中，考察了提取溶剂、提取时间2个因素，并显示最佳条件是每5 g成药粉末加50%甲醇，超声提取20 min。

　　3.3色谱条件的优化

　　结合已有文献可知，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液时，指纹图谱峰质量较好，能有效分离各指标成分，信号强度较好。选取215 nm波长时，响应值最多，峰信息量大且基线平稳。因此，可将该波长当作检测波长。

　　3.4指纹图谱分析

　　文章从12批样品的指纹图谱中提取到了12个共有峰，并将其与混合对照品色谱图进行比对，确定了3个成分。其中，升麻素苷为峰3；毛蕊异黄酮葡萄糖苷为峰5；5-O-甲基维斯阿米醇苷为峰7。

　　4结语

　　文章在现行标准基础上优化了黄芪、白术、防风的TLC鉴定方法，并建立了测定保儿宁颗粒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总量的新方法。该方法具有较好的精密度和准确度，可为保儿宁颗粒的质量评价及标准制订提供依据。同时，文章也建立了简单、实用、专属性强的保儿宁颗粒HPLC指纹图谱法，可客观、系统地评价保儿宁颗粒质量，为完善保儿宁颗粒的质量标准提供一定的实验依据。

　　［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015版)［M］.北京:中国医药科技出版社,2015.

　　［2］王永珍.中药鉴定学［M］.北京:中国中医药出版社,1997.

　　［3］胡安青,何寅.HPLC法测定保儿宁颗粒中升麻素苷的含量［J］.北方药学,2017,14(4):4,155.

　　［4］孙冬梅,陈秋谷,李养学,等.清热疏肝颗粒的质量标准研究［J］.广东药学院学报,2016,32(5):601-605.