摘要：文章通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系制备抗CD47单克隆抗体，并对其进行综合表征，实现了对其结构验证和作用原理的深入探究。具体采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对单抗分子质量、氨基酸覆盖率、二硫键连接方式进行结构表征，同时通过阻断试验研究其与CD47的相互作用。结构确证显示，单抗分子质量与理论一致，氨基酸覆盖率达100%；二硫键配对方式与理论一致。阻断实验证明，anti-CD47可与CD47-his结合，并阻断CD47-his与信号调节蛋白α（SIRPα)的结合。该靶向单抗的分子结构与理论设计结构一致，可特异性结合CD47，阻断CD47-SIRPα信号轴，显示出了潜在的抗肿瘤效果。

　　关键词：CD47；结构表征；阻断作用；超高效液相色谱串联质谱

　　CD47是一种普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，是细胞增殖、迁移和免疫反应调节等多种生理过程的关键调节因子。CD47主要与信号调节蛋白α（SIRPα)相互作用，释放“别吃我”的信号[1-2]，从而发挥抑制吞噬的作用，实现免疫逃逸。继PD-1/PD-L1后，CD47-SIRP琢阻断已成为各种恶性肿瘤中一个高度竞争的免疫检查点[3]。现有研究表明，CD47单抗不仅可以阻止CD47与SIRP琢的结合，还可以与巨噬细胞上的激活型Fc酌受体（Fc酌R）结合，向巨噬细胞传递强大的吞噬信号[4]，进而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，有效连接先天和适应性免疫实现抗肿瘤效果[5]。

　　1仪器与材料

　　实验仪器：高分辨质谱仪Triple-TOF 6600（AB Sciex公司）；超高效液相色谱ExionLC（AB Sciex公司）；Octet（PALL）；恒温振荡培养箱HZQ-F160（HDL APPARATUS）；移液器（Eppendorf）；CO2培养箱（Thermo）；高速冷冻离心机（Eppendorf）。

　　材料：甲酸（Thermo Fisher）；乙腈（Thermo Fisher）；三氟乙酸（Thermo Fisher）；二硫苏糖醇（Promega）；糖苷酶F（NEB）；盐酸胍（国药集团）；乙二胺四乙酸二钠（国药集团）；三羟甲基氨基甲烷（中国惠世试剂）；盐酸（北京化工厂）；碳酸氢铵（Sigma）；碘乙酰胺（Sigma）；胰蛋白酶（Promega）；Glu-C酶（Roche）；胰凝乳蛋白酶（Roche）；N-乙基马来酰亚胺（Thermo）；Lys-C酶（Wako）；尿素（Sigma）；一水合柠檬酸（国药集团）；氯化钠（国药集团）；磷酸氢二钠（湖南九典）；磷酸二氢钾（北京化工厂）；CD47-his（ACRO）；SIRPα-his（ACRO）。

　　色谱柱Thermo MAbPacTM RP，4μm，2.1 mm×100 mm；Waters ACQUITY UPLC Peptide BEHC18，300 A，1.7μm，2.1 mm×100 mm。

　　2方法与结果

　　2.1质谱分子质量分析

　　2.1.1单抗供试品的处理

　　未切糖样品处理：取单抗用20 mM NH4HCO3稀释至1 mg/mL。

　　切糖后样品处理：取单抗用20 mM NH4HCO3稀释至12 mg/mL，按照100:1的质量比（W/W）加入PNGase F，37℃孵育过夜。

　　2.1.2色谱条件

　　流动相A：0.02%三氟乙酸，0.1%甲酸-水；流动相B：0.02%三氟乙酸，0.1%甲酸，-90%乙腈水；检测波长：210~220 nm；流速：0.3 mL/min；柱温：70℃;色谱柱：Thermo MAbPacTM RP，4μm，2.1 mm×100 mm；运行时间：15 min；洗脱程序为：0.01~1 min 20%B、1~11 min 20%~45%B，保持1 min；12~14 min 45%~20%B，保持1 min。

　　2.1.3质谱条件

　　样品采用Triple-TOF 6600高分辨质谱仪进行质谱分析，GS1：50；GS2：50；CUR：35；TEM：550℃;ISVF：5 500 V；m/z：600~5 000；Accumulation Time：0.25 s；Time Bins To Sum：40；DP：250；CE：10；CAD：4。

　　2.1.4质谱分子质量结果

　　供试品使用高分辨质谱仪Triple-TOF 6600进行检测。切糖前后的相对分子质量如表1所示。切糖前后相对分子质量与理论分子质量误差均小于5 Da，表明分子质量测定结果与理论分子质量一致。

　　变性还原：取200 mg单抗样品，加入5mL 1 mol/L的Tris-HCl、75 mL 8 mol/L的盐酸胍、1 mL 0.5 mol/L的EDTA、2 mL 1 mol/L的DTT，用水补足体积至100 mL，混匀，56℃孵育1 h。

　　烷基化：将5 mL 1 mol/L的碘乙酰胺加入变性后的样品中，混匀，并于室温避光孵育30 min。

　　置换：用20 mM NH4HCO3将烷基化样品置换，稀释成蛋白质量浓度约1 mg/mL的溶液。

　　酶解：分别取50 mg置换后样品，加入2 mL 0.5 mg/mL的Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C，37℃孵育过夜，离心取上清液检测。

　　2.2.2色谱条件

　　流动相A：0.05%三氟乙酸-水溶液；流动相B：0.05%三氟乙酸-乙腈溶液；检测波长：210~220 nm；流速：0.25 mL/min；进样体积：20μL；柱温：40℃;运行时间：80 min；洗脱程序为：0.01~2 min 0%B，2~72 min 0%~37%B，72~72.5 min 37%~90%B，保持1.5 min；74~74.5 min 90%~0%B，保持5.5 min。

　　2.2.3质谱条件

　　经超高效液相色谱分离后用Triple-TOF 6600质谱仪进行检测分析。分析时长80 min，检测方式为正离子。TOF MS参数：GS1：50；GS2：50；CUR：35；TEM：550℃;ISVF：5 500 V；m/z：200~1 800；Accumulation Time：0.5 s；Time Bins To Sum：4；DP：80；CE：10；CAD：4。Product Ion参数：GS1：50；GS2：50；CUR：35；TEM：550℃;ISVF：5 500 V；m/z：50~1 600；Accumulation Time：0.1 s；Time Bins To Sum：4；DP：80；CE：Rolling CE。

　　2.2.4氨基酸序列覆盖率结果

　　经LC-MS/MS采集样品并分析整合数据后[6-7]，单抗轻链和重链肽段的覆盖率均达到100%。结果如表2所示。

　　2.3二硫键分析

　　2.3.1单抗供试品的处理

　　蛋白质变性：取200 mg anti-CD47加入200 mL 3 mol/L的盐酸胍，室温条件下变性1 h。

　　烷基化：将4 mL 0.4 mg/mL的NEM加入变性后的样品中，室温孵育30 min。

　　酶解：用1 M Tris-HCl-1M urea（pH 7.0）溶液将烷基化后样品进行置换。超滤完成后，将蛋白质量浓度控制在1 mg/mL左右。先加入4 mL 0.5 mg/mL的Lys-C，37℃孵育8 h，再加入4 mL 0.5 mg/mL的Chymotrypsin，37℃孵育过夜。取出后放置于4℃冰箱终止反应，离心取上清液检测[8-9]。

　　2.3.2色谱条件

　　流动相A：0.05%三氟乙酸-水溶液；流动相B：0.05%三氟乙酸-乙腈溶液；检测波长：220 nm；流速：0.25 mL/min；进样体积：20 mL；柱温：40℃;运行时间：80 min；色谱柱Waters ACQUITY UPLCPeptide BEH C18，300 A，1.7μm，2.1 mm×100 mm。

　　洗脱程序：0.01~2 min 0%B，2~72 min 0%~37%B，72~72.5 min 37%~90%B，保持1.5 min；74~74.5 min 90%~0%B，保持5.5 min。

　　2.3.3质谱条件

　　单抗供试品经超高效液相色谱分离后，用Triple-TOF 6600质谱仪（AB Sciex）进行质谱检测分析。分析时长为80 min，检测方式为正离子。TOF MS参数：GS1：50；GS2：50；CUR：35；TEM：550℃;ISVF：5 500 V；m/z：200~1 800；Accumulation Time：0.5 s；Time Bins To Sum：4；DP：80；CE：10；CAD：4。Product Ion参数：GS1：50；GS2：50；CUR：35；TEM：550℃;ISVF：5 500 V；m/z：50~1 600；Accumulation Time：0.1 s；Time Bins To Sum：4；DP：80；CE：Rolling CE。

　　2.3.4二硫键分析结果

　　经质谱数据分析发现，轻链内含有2对二硫键；重链内含有4对二硫键及3种链间二硫键，且所有二硫键肽段理论分子质量和实测分子质量均满足误差小于0.1Da的要求，确认二硫键的位置均与理论二硫键位置一致。结果如表3所示。

　　2.4阻断实验研究

　　2.4.1单抗供试品的制备

　　用PBS将单抗稀释至10 mg/mL；将CD47-his稀释至500 nmol/L；将SIRPα-his稀释至500 nmol/L；PBS缓冲液作为Baseline；再生液为pH 1.5的甘氨酸溶液；中和液为pH 7.4的PBS缓冲液。

　　2.4.2样品的检测

　　将ProA传感器在PBS中预湿30 min。将样品分别置于板孔中，并以PBS为对照孔，每孔200 mL。

　　步骤检测：（1）按照Baesline-（SIRPα-his）的顺序进行检测，检测时间分别为60、120 s；（2）按照Baesline-（CD47-his）顺序进行检测，检测时间分别为60、120 s；（3）按照Baesline-单抗的顺序进行检测，检测时间分别为60、120 s；（4）按照Baesline1-单抗-Baesline2-(CD47)的顺序进行检测，检测时间分别为60、120、60、120 s；（5）按照Baesline1-单抗-Baesline2-(CD47-his)-Baesline3-（SIRPα-his）的顺序进行检测，检测时间分别为60、120、60、120、60、120 s；（6）按照Baesline1-单抗-Baesline2-（SIRPα-his）的顺序进行检测，检测时间分别为60、120、60、120 s。检测前后分别对探针进行再生及中和，时间为5 s，重复3次。

　　2.4.3阻断实验结果分析

　　采用OCTET方法，使用Protein A探针，捕获单抗，并依次结合CD47-his和SIRPα,考察已与本品结合的CD47-his能否继续与SIRPα结合。试验结果显示，在分子水平上，单抗可与CD47-his结合，同时也可阻断CD47与SIRPα结合。结果如图1、表4所示。

　　3结论

　　本文通过转染CHO细胞系制备了IgG4型抗CD47单克隆抗体，并发现该抗体能够阻断CD47与SIRPα的相互作用，避免过度激活免疫反应。同时，研究利用LC-MS/MS技术对抗体进行了结构确证。结果显示，分子质量与理论值一致，氨基酸覆盖率达100%，并确认了16个二硫键的位置。此外，还采用OCTET技术分析了抗体的生物学特性，证实了其能够特异性结合CD47-his并阻断其与SIRPα的相互作用。

　　综上所述，通过表征靶向单抗的分子结构和生物学性质，可为CD47靶向治疗提供新的理论和实验数据，为临床应用打下基础。

　参考文献

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