摘要：地下空间进驻人员的身体健康与空间环境的质量密切相关。文章从国内外地下空间微生物环境、人居健康环境的相关理论研究出发，收集不同深度的地下空间环境样本，并测定其微生物数量和种类，通过分析不同深度地下空间中的细菌、真菌污染状况及其分布特点，为相关人员在深地空间中长期生活和工作提供有效的防护措施。

　　关键词：地下空间；微生物；细菌；真菌

　　本文立足于开发利用地下空间，为打造适宜的人居环境，开展深地空间心理和生理健康调查研究、环境微生物调查检测、污染控制防范。空气中存在的细菌、真菌等微生物与人们的生产和生活形影不离，通过尘埃、飞沫等途径进行传播，影响着人们的身体健康。为深入了解深地空间的卫生状况，并以此为制订相应的防控措施提供科学的依据，本文将收集空间环境样本、测定微生物数量、种类，并分析微生物分布特征。

　　1主要实验仪器和试剂

　　Andersen空气微生物采样器（PSW-6）；液体撞击式空气微生物采样器（PSW-Y）；温湿度计

　　（TS1360A）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KB）；洁净工作台（SW-CJ-1BU）；隔水式恒温培养箱（GRP-9160）；手动平板计数仪（aCOLad）；微生物鉴定仪（GENIII）；电泳仪（MINIP-4）；凝胶成像系统。

　　2环境样本采样方式及样本采集情况

　　2.1空气采样

　　采样点的数量参照《公共场所卫生检验方法第6部分卫生监测技术规范》（GB/T 18204.6-2013）、《室内空气质量标准》（GB/T18883-2022），综合考虑居室面积、现场状况等因素进行确定。每100 m2选取3~5个点，要求均匀分布、呈对角线或梅花形。采用安得森空气微生物采样器，分区进行3次采样，每2次重复。空气流量为28.3 L/min，采样20 min。采样点需避开通风口，相对高度在0.5~1.5 m之间，与人的呼吸带高度保持一致，且距墙壁0.5 m以上。采样后，样品置于无菌封口袋中于4℃条件下保存。

　　2.2土壤样本的处理与保存

　　墙壁、地面等环境样本平行取样3次。样本采集完成后，部分用于微生物测试的土壤依照《土壤质量取样第6部分实验室中微生物工艺、生物统计和多样性评估用有氧条件下土壤的收集、处理和存贮的指南》（ISO 10381-6-2009）[1]中的方法进行样本处理。样品装在无菌封口袋中于4℃条件下保存，3个月内完成测试。

　　2.3水样采集

　　采集水样前，应选择具磨口塞的玻璃瓶或具螺口的塑料瓶，并清洗干净。采样时，需先将采样瓶润洗2～3次，不要装满，留出5～10 mL的空间；采样后，塞紧瓶塞。水质样品应尽快进行分析，如不能及时分析，则应将样品置于阴暗处、5℃以下保存。

　　2.4样本采集情况

　　为对深地空间展开深入调查，本文对位于陕西南部的钨矿区、钒矿区、铅锌矿区进行样本采集。选择0~800 m范围内不同深度环境空间中的空气、水、土壤样本进行布点取样。采集空气样本51份、水样本15份、环境土壤样本22份。

　　3微生物群落分析

　　3.1微生物菌落总数检测

　　采用梯度稀释平板培养计数法统计样本中可培养的细菌、真菌总数。具体如表1所示。

　　3.1.1菌落计数

　　样品用无菌生理盐水稀释至10-5（稀释倍数），细菌平板取三个稀释度，涂布平皿。共涂布两组作为平行对照，35℃条件下进行培养，每天观察，菌落基本成形时即停止培养并计数。真菌稀释梯度选择培养7 d。

　　3.1.2菌株的分类鉴定

　　将效果较好的功能菌株分别在固体LB平板划线，于37℃条件下恒温培养至长出单菌落。分别挑取单菌落至5 mL液体LB培养基中，并置于37℃摇床中振荡培养，摇床转速为180 r/min，待长到一定菌浓后提取基因组。

　　使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒依次提取各单菌菌株基因组[2]，并将提取出的基因组用0.5%琼脂糖凝胶检测其大小与浓度。若所提取的基因组DNA大小在23 Kb以上，则可用于后续实验。

　　使用细菌、真菌基因通用引物27f/1492r扩增各单菌16SrRNA基因[3]，扩增出的片段长约为1.5 Kb。将所扩增的片段连接到pMD19-T载体上，并将其转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，再涂布于含有一定浓度AMP的抗性LB固体平板上，筛选阳性克隆。得到阳性克隆后进行序列测定，并将测得的序列在GenBank中进行比对，得到各菌株序列信息。

　　3.1.3真菌菌株鉴定

　　将真菌菌株用沙保罗培养基进行培养后，对菌落形态特征进行宏观观察及玻片培养，并在显微镜下观察其生长结构，以鉴定真菌菌株。

　　3.2样品可培养微生物菌数特征

　　对平板上生长的菌落进行计数。结果表明，细菌占可培养微生物总数的80%以上，且受深度环境的影响较大，而真菌数量受深度环境的影响程度较小。

　　3.3典型可培养真菌菌株的分析

　　3.3.1样品中可培养真菌的分布特征

　　样品中典型真菌种类及其具体分布如表2所示。

　　由于地下空间长期得不到阳光照射，又一直受到通风、气温、气湿等因素的影响，因此其真菌污染情况较为普遍。地下空间内的真菌主要来自外界进入和空间内部大量腐殖质的繁殖，同时真菌孢子会随着空气流动向周围散播，并逐步扩大污染范围。即使在密闭状态下，由于不同部位的气温存在高低差异，微弱的空气对流也足以使真菌孢子向四处飘散[4]。

　　3.3.2地下空间真菌污染危害

　　第一，使人体感染。空气真菌主要通过吸入途径进入人体并引发呼吸道感染，或者一直定植在体内，当机体免疫力下降时便会引起感染，从而诱发病变[5]。

　　第二，某些真菌在生长繁殖过程中会产生有毒代谢产物。主要产毒真菌有曲霉属、青霉属、镰刀属、链格孢属等。在本文所检出的真菌中，以上4种菌属均具有优势。这些菌产生的毒素可随空气中的悬浮颗粒经呼吸道沉积于肺泡，或经皮肤进入人体，进而影响人体健康。同时，真菌毒素亦可污染地下空间中储存的食品，被人食用后可以使人中毒甚至患癌。

　　第三，引发过敏反应。过敏反应与真菌接触的时间、频度及剂量呈正相关。在特定的环境下，真菌越多，接触越频繁，持续时间越长，引发过敏反应的可能性就越大。

　　第四，影响地下空间中存放的粮食、食品、药品等物质，容易引起霉变而影响其质量，尤其是对地下空间内储水的影响较大。

　　3.4典型可培养细菌菌株的分析

　　运用微生物分离技术鉴定地下空间环境中的典型细菌。其具体种类及分布如表3所示。

　　4讨论与总结

　　本文通过对陕西南部矿井区地下空间中不同来源样品中的可培养微生物群落展开分析，证实了可培养细菌占土壤微生物总数的80%以上，具有主导地位，且会随着地下深度的提升而有所增加；可培养细菌菌株中芽孢杆菌属多数，其他微杆菌属、葡萄球菌属和志贺菌属为少量。真菌数量受空间深度的影响较小，真菌环境造成的影响恢复能力较强；可培养的真菌菌株中且会青霉属、曲霉属、镰刀菌属、链格孢属占据优势。

　　参考文献

　　［1］国际标准化组织.土壤质量.取样.第6部分:实验室中微生物工艺、生物统计和多样性评估用有氧条件下土壤的收集、处理和存贮的指南:ISO 10381-6-2009［S］.北京:中国标准出版社,2009.

　　［2］陶兰兰,向玉萍,王定勇,等.1株兼具好、厌氧汞甲基化能力细菌的分离鉴定［J］.环境科学,2016,37(11):4389-4394.

　　［3］高喜燕,刘鹰,郑海燕,等.一株海洋好氧反硝化细菌的鉴定及其好氧反硝化特性［J］.微生物学报,2010,50(9):1164-1171.

　　［4］张永良,郑世英,智强,等.不同类型地下工事空气真菌检测分析［J］.环境与职业医学,2007(4):454-455.

　　［5］张永良,侯小平,关宏坤,等.军事坑道内空气微生物污染调查及其消毒［J］.军事医学科学院院刊,2008(1):39-41.