摘要：两步水热法制备的四氧化三铁二氧化铈（Fe3O4 CeO2）具有过氧化物模拟酶活性，可催化H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）生成蓝色的氧化产物（TMBox）。通过与尿酸酶对尿酸的催化反应进行级联，开发了高灵敏、高特异性的尿酸比色检测新方法。该方法测定尿酸的线性范围为10~100μmol/L，检测限为7.9μmol/L，结果准确可靠。

　　关键词：过氧化物模拟酶；尿酸；比色检测

　　尿酸是白血病、恶性肿瘤化疗以及心脑血管疾病的风险监测因子，因此，尿酸的检测备受关注[1]。目前，临床和实验室用于尿酸检测的方法存在操作复杂、成本高、稳定性差等问题[2]。

　　天然过氧化物酶结构不稳定、重复利用率低且价格高，而纳米模拟酶在模拟天然酶活性的同时可弥补天然酶的不足，在诸多具有类酶活性的纳米材料中，磁性Fe3O4因具有成本低、表面易功能化和良好的生物学兼容性受到研究人员的青睐[3]。本文通过两步水热法制备了Fe3O4 CeO2模拟酶，并通过与尿酸酶的催化反应级联，实现尿酸高灵敏度、高选择性、低成本、快速的可视化检测。

　　1实验部分

　　1.1仪器与试剂

　　透射电子显微镜，FEI Tecnai F20，赛默飞；紫外-可见分光光度计，UV-2450，岛津；pHS-25酸度计，雷磁。

　　尿酸和尿酸氧化酶，上海鼓臣生物技术有限公司；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）、H2O2，上海国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸三钠、乙二醇、醋酸、醋酸钠、六水合硝酸铈、氯化铁、乙醇、六亚甲基四胺等，上海泰坦科技股份有限公司。实验中所用水为超纯水。

　　1.2过氧化物模拟酶的制备

　　将0.202 5 g柠檬酸三钠和0.651 3 g氯化铁充分溶解于20 mL乙二醇后加入1.253 7 g醋酸钠，磁力搅拌20 min混匀，转移至反应釜，在200℃水热反应10 h。冷却至室温后分别用超纯水、无水乙醇洗涤沉淀3次并磁分离收集，60℃真空干燥，得到Fe3O4纳米粒子。

　　取0.100 3 g以上所得Fe3O4纳米粒子分散至40 mL 50%的乙醇中，加入35 mg六水合硝酸铈和30 mg六亚甲基四胺后转移到反应釜中，在100℃下反应2h。冷却后分别用超纯水、无水乙醇洗涤沉淀3次并磁分离收集，60℃真空干燥得到Fe3O4 CeO2过氧化物模拟酶。

　　1.3 Fe3O4 CeO2模拟酶活性的探究

　　向盛有100μL 5 mmol/L TMB溶液的离心管中分别加入2 mL醋酸钠缓冲液（pH=4.0，0.2 mol/L）、10μL 0.5 mg/mL的Fe3O4 CeO2和10μL 50 mmol/L的H2O2，37℃水浴中反应20 min后磁分离去除Fe3O4 CeO2，上清液转移到吸收池中测量吸收光谱。

　　1.4尿酸的比色检测

　　尿酸检测参考文献[4]的方法，第一步，将10μL 10 g/L的尿酸氧化酶和200μL不同浓度的尿酸分散在pH=8.4的硼酸盐缓冲液中，混合液在37℃水浴中反应20 min；第二步，10μL 0.5 mg/mL的Fe3O4 CeO2、100μL的TMB（5 mmol/L）、2 mL醋酸钠缓冲溶液（0.2 mol/L，pH=4.0）加入到第一步中的尿酸反应液中充分混匀，37℃水浴中反应20 min，磁分离Fe3O4 CeO2后测吸收光谱。

　　2结果与讨论

　　2.1 Fe3O4 CeO2的表征与模拟酶特性研究

　　按照1.2步骤所制备的Fe3O4 CeO2的透射电子显微镜图见图1，CeO2纳米粒子均匀负载在Fe3O4纳米粒子表面形成分散性良好的核壳结构的Fe3O4 CeO2。

　　2.2 Fe3O4 CeO2过氧化物模拟酶特性研究

　　以TMB为反应底物，H2O2为氧化底物，评价所制备Fe3O4 CeO2的过氧化物模拟酶特性。结果表明，H2O2不能单独氧化TMB使其变色；Fe3O4 CeO2和TMB共存时，652 nm处无明显吸收；Fe3O4 CeO2、TMB和H2O2共存的反应体系在652 nm处有较强吸收，证明生成了蓝色的TMB氧化产物。以上结果表明Fe3O4 CeO2具有良好的类过氧化物酶活性。

　　纳米模拟酶和天然酶辣根过氧化物酶的催化活性均受体系pH值影响[5]。实验了pH从2到10变化对Fe3O4 CeO2类过氧化物酶催化性能的影响。结果表明，当pH=4时，652 nm处吸光度值最大，证明此时Fe3O4 CeO2的催化活性最强。因此，实验选择pH=4作为该纳米模拟酶催化反应的最佳pH值。

　　研究了底物H2O2在不同浓度下Fe3O4 CeO2对TMB-H2O2体系的催化效果，图2、图3表明，Fe3O4 CeO2的催化活性随H2O2浓度的增加先增大后趋于稳定，在1~20μmol/L范围内的线性方程为A=0.012 22+0.012 1c，r=0.999（c为H2O2浓度，A为652 nm处吸光度值）。

　　2.3尿酸的测定

　　根据Fe3O4 CeO2能够催化氧化过氧化物酶底物的酶学特性，与尿酸氧化酶催化氧化尿酸的反应耦合，通过直接检测H2O2从而实现尿酸的间接测定。图4为该方法检测尿酸的吸收光谱，652 nm处吸收峰随尿酸浓度的增加而增大，在10~100μmol/L范围内，尿酸浓度与吸光度呈线性，线性方程为A=0.172+0.002 96c，r=0.992（c为尿酸浓度，A为652 nm处吸光度值），检测限为7.9μmol/L。

　　血清样品高速离心后取上清液稀释20倍后做加标回收实验，回收率为83%~105%，相对标准偏差（RSD）为5.25%，表明该方法准确度良好，可用于尿酸浓度的检测。

　　3结论

　　本研究通过两步水热法制备具有优异催化活性的Fe3O4 CeO2磁性过氧化物模拟酶，并与尿酸氧化酶级联构建尿酸的酶催化反应体系，实现尿酸高选择性、低成本的比色检测，测定尿酸的线性范围为10~100μmol/L，检测限为7.9μmol/L，为尿酸检测提供了一种新思路。

　　参考文献

　　[1]Francesca C,Pietro S,Anna M C,et al.Uric acid in metabolic and cerebrovascular disorders:a review[J].Current Vascular Pharmacolo-gy,2020,18(6):610-618.

　　[2]张海晨，李水军，孙贺伟，等.液相色谱-串联质谱法测定尿酸及与常规检测方法的比较[J].检验医学，2015，30（5）：422-426.

　　[3]唐倩倩，张艺凡，和媛.磁性纳米材料的生物医学应用进展[J].生物化学和生物物理进展，2019，46（4）：353-368.

　　[4]焦雪，钱昊，刘文昊，等.Mo/CeO2作为模拟酶应用于尿酸和L－半胱氨酸检测[J].广州化工，2019，47（10）：96-99.

　　[5]唐雨榕，张玉，刘睿，等.NaYF4：Yb，Er纳米粒子作为过氧化物模拟酶用于尿酸检测[J].分析化学，2013，41（3）：330-336.