[摘要] 目的 研究和分析 Doublecortin 样激酶-1(Doublecortin Like Disease 1. DCLK1)单克隆抗体在结肠癌中的 表达情况与相关影响因素。 方法 选取 2018 年 7 月—2022 年 6 月哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院收治的 73 例结直肠癌患者作为研究对象，根据患者肿瘤组织中 DCLK1 表达水平，将其分为 DCLK1 低表达组(n=31) 与 DCLK1 高表达组(n=42)，分析 DCLK1 单克隆抗体在结直肠癌中表达的影响因素。 结果 DCLK1 高表达组 与 DCLK1 低表达组肿瘤直径、肿瘤分期(Tumor Node Metastasis, TNM)、浸润深度、淋巴结是否转移、有无脉 管、肿瘤病灶是否远处转移及肿瘤分化程度对比，差异有统计学意义(P 均<0.05)。多因素 Logistic 回归分析 研究结果表明，肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影响因素包括淋巴结转移、浸润深度、TNM 分期、肿瘤直径、肿 瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度(OR=1.079、1.235、1.548、1.784、1.745、2.026.P 均<0.05)。 结论 肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影响因素包括淋巴结转移、浸润深度、TNM 分期、肿瘤直径、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化 程度，临床可通过检测上述指标的方式判断肿瘤组织中 DCLK1 表达水平。

　　[关键词] 结直肠癌,DCLK1 单克隆抗体,表达情况,影响因素

　　结直肠癌属于临床常见的消化系统恶性肿瘤， 近年来，受环境问题、人口老龄化加重等因素的影 响，结直肠癌发病率不断升高[1-2]。手术为结直肠 癌的根治手段，能够祛除病灶，降低肿瘤病灶复发 风险以及转移风险，对于延长患者生存周期具有非 常重要的意义，但是中晚期结直肠癌患者需要配合 放化疗等手段以进一步提高病情控制效果并有效延 长患者生存周期，早期准确诊断和治疗对于改善患 者生存质量有重要意义[3-4] 。Doublecortin 样激酶-1 (Doublecortin Like Disease 1. DCLK1)属于 Doublecor‐ tin 家族及蛋白激酶家族成员。研究表明，DCLK1 在结直肠细胞系中存在癌症干细胞样特征，与病情 进展及预后存在重要关联[5]。本研究选取 2018 年 7 月—2022 年 6 月哈尔滨工业大学附属黑龙江省立 医院收治的 73 例结直肠癌患者作为研究对象，分 析 DCLK1 单克隆抗体在结直肠癌中的表达情况以 及与患者预后相关性，以期为临床评估患者病情严 重程度以及预测患者预后提供指导，现报道如下。

　　1 资料与方法
       1.1 一般资料

　　选取本院收治的 73 例结直肠癌患者作为研究 对 象 ，其 中 男 44 例 ，女 29例 ;年 龄 27~79 岁 ，平 均 (60.16±5.04)岁。根据患者肿瘤组织中 DCLK1 表达水平将其分为DCLK1 低表达组与DCLK1高表达组，分别纳入例数为 31 例、42 例。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者与家属知情同意 ( SYYLLBA202161)。

　　1.2 纳入与排除标准

　　纳入标准：①经纤维结肠镜检查及病理活检确 诊病情;②具有非常完整的临床资料;③术前未接受过化疗、放疗等治疗;④年龄>18 岁。

　　排除标准：①处于妊娠期、哺乳期女性患者;② 合并其他恶性病变或者系统性疾病患者;③ 伴精 神、智力、理解或者沟通能力障碍患者;④DCLK1 检 测结果不明确或者无法对检测结果进行准确判定患者。

　　1.3 方法

　　肿瘤组织中 DCLK1 单克隆抗体检测方法如下： 针对结直肠癌石蜡切片实施脱蜡，直至脱水，以乙 醇实施梯度脱水。切片染色通过 Harris 苏木素进 行，时间为 3~8 min，然后于自来水下冲洗，采用 1% 盐酸乙醇进行分化，数秒后以自来水进行冲洗，返 蓝操作通过 0.6% 氨水实施，返蓝完成后在流水下 冲洗。切片应用伊红染液对切片实施持续染色( 1~ 3 min)，脱水后实施封片操作，通过乙醇取得梯度脱 水效果。将切片稍晾干，然后脱水封片，封片采用中 性树胶，在显微镜下读片后拍照。将直径为 4 μm 的 结直肠癌组织切片以石蜡包埋 ，烤片 1 h，然后在 室 温 状 态 下 放 置 ，连 续 浸 泡 15 min。 通过罗氏全自动免疫组化仪上实施切片运动，程序如下：脱蜡 15 min 后通过抗原修复缓冲液使 pH 至 8.5.然后持 续修复 30 min，以血清实施封闭( 15 min)，将一抗 100 μl 滴入其中，在 37℃ 温度下连续孵育 30 min， 通 过 二 抗 孵 育 ，时 间 为 20 min，然 后 DAB，时 间 为 6 min，苏木素 3 min，返蓝液 3 min。对切片进行梯 度乙醇脱水，然后实施干燥及二甲苯透明，通过中 性树胶封片，在显微镜下读片并拍照。观察细胞质 颜色，若可见棕黄色或者黄色即为染色。无染色计 0 分，轻微染色计 1 分，中度染色计 2 分，强染色计算3 分。如下为染色面积评估标准：无染色计 0分;染色细胞占 0%~<30% 计 1分;染色细胞占 30%~<60% 计 2分;染色细胞≥60% 计 3 分。最终得分即为染色 深浅得分×染色面积得分，以评分>4 分为高表达。

　　1.4 观察指标

　　①分析肿瘤组织中 DCLK1 表达水平与结直肠 癌患者病理特征，包括患者的年龄、性别、肿瘤分期 (Tumor Node Metastasis, TNM)分期、淋巴结转移、肿 瘤直径、浸润深度、有无脉管、是否出现肿瘤病灶远 处转移以及肿瘤分化程度。

　　②分析肿瘤组织中 DCLK1 表达水平影响因素。

        1.5 统计方法

　　采用 SPSS 23.0 统计学软件分析数据，肿瘤组织 中 DCLK1 表达水平与结直肠癌患者病理特征为计 数资料，以例数(n)和率(%)表示，进行 χ2 检验。筛选影响肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平的相关因素， 选择单因素分析中 P<0.05 的变量进行多因素Logis ‐ tic 回归分析，计算相对危险度(OR)和 95% 可信区 间(95%CI)。 P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肿瘤组织中 DCLK1 表达水平与结直肠癌患者 病理特征分析

　　DCLK1 高表达患者共计 42 例，DCLK1 低表达 患者共计 31 例，DCLK1 高表达组与 DCLK1 低表达 组患者年龄、性别对比，差异无统计学意义(P 均> 0.05);两组患者肿瘤直径、肿瘤组织 TNM 分期、浸 润深度、淋巴结是否转移、有无脉管、肿瘤分化程 度、肿瘤病灶是否远处转移对比，差异有统计学意 义(P 均<0.05)。见表 1.

　　2.2 肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影响因素分析

        以 DCLK1 高表达组与 DCLK1 低表达组具有统计学意义的单因素为因变量，肿瘤组织中 DCLK1 高 表达水平为自变量实施多因素 Logistic 回归分析。

　　研究结果显示，肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影响 因素包括 TNM 分期、淋巴结转移、肿瘤病灶远处转移、肿瘤直径、浸润深度、肿瘤分化程度(P 均< 0.05)。见表 2.

　　3 讨论

　　结直肠癌与人们生活方式和饮食结构等因素 存在关联，结直肠癌发生率呈升高趋势，现阶段，结 直肠癌诊治水平已经获得了显著的进步，患者生存 周期获得了延长，但是患者预后以及远期生存率仍 然不佳。侵入性内径检查联合病理活检为临床诊 断结直肠癌的主要手段，但是作为有创性检查，上 述检查方式应用受限，因此，有必要需求辅助性诊 断手段以提高结直肠癌检出率。

　　肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展以及转移和复发 中发挥着至关重要的作用，癌症的治疗过程中如不 能使癌症干细胞得到有效清除，癌症很容易发生复 发和转移。 DCLK1 可作为肿瘤干细胞的特异性表 面标志物，开发抗 DCLK1 特异性抗体对于肿瘤干细 胞的特异性诊断和治疗具有重要的意义。人类染 色体 13q13 上可见 DCLK1 编码基因，乳腺癌、胰腺 癌、前列腺癌等组织上皮细胞的基质和细胞质中均 可检出 DCLK1.不但与肿瘤病灶转移存在关联，同 时也会影响患者预后。结直肠癌细胞系中 DCLK1 存在癌症干细胞样特征，表明 DCLK1 在结直肠癌早 期诊断具有一定的价值，可对肿瘤复发及预后等相 关情况进行预测[6-7]。

　　结直肠癌在全世界范围内均属于高度病态疾 病及致命性疾病，尽管 P53、KRAS 及 APC 等多种致 癌基因与肿瘤抑制基因被发现，但是受低频率体细 胞突变等因素的影响，导致结肠癌存在异质性，此 外，受潜在功能突变等因素的影响，结肠癌临床完 全治愈率极低，严重危及患者生命安全[8]。部分大 肠癌可通过子代组成细胞表型变异，干细胞存在为 癌症发生和进展的重要原因，在结直肠癌增殖与转 移过程中均能够发挥重要的驱动作用。肿瘤干细胞可产生其他肿瘤细胞 ，DCLK1 为肿瘤干细胞标 志 ，可 通 过 抑 制 肿 瘤 生 长 的 微 小 RNA(miRNA)及 Let-7a 含量增加，进而可使促进肿瘤发生的上皮间 质转化及肿瘤干细胞基因的转录因子表达降低[9]。

　　DCLK1 在神经元迁移、神经元凋亡、神经元逆性 运输及凋亡等过程中均可发挥作用，其微管聚合活 动能不受其他蛋白激酶活性的影响，DCLK1 在钙信 号通路控制发育中的大脑神经元迁移过程中以及成 熟神经系统发挥过程中可能发挥了一定的参与作 用[10-11] 。 与 正 常 人 结 肠 黏 膜 相 比 ，结 直 肠 癌 患 者 DCLK1 表达水平显著升高。 DCLK1 为存在于癌症 及正常干细胞中的蛋白质，可通过原癌基因 c-Myc 基因及 pri-let-7a miRNA 基因的调控作用促进肿瘤 发生和发展。肿瘤干细胞可生成其他肿瘤细胞，与 亲代细胞相比，肿瘤干细胞的能力显著更强。肿瘤 干细胞中的 DCLK1 上调可能与细胞增殖能力显著 增强存在关联[12]。本研究中，多因素 Logistic 回归分 析研究结果表明，肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影 响因素包括浸润深度、淋巴结转移、肿瘤病灶远处转 移、TNM 分期、肿瘤直径、肿瘤分化程度(P 均<0.05)。

　　现阶段，临床关于 DCLK1 在肿瘤发展重要环节 中所发挥的重要作用尚缺乏了解，DCLK1 表达上调 在结直肠肿瘤中可能为早期事件，高 DCLK1 表达不 但能够于原发性肿瘤中检出，同时也能够于远端转 移中检出[13] 。DCLK1 在结直肠癌、食管癌以及胰腺 癌等多种肿瘤细胞中表达水平较高，而且与肿瘤生 长、侵袭以及转移等存在密切关联，TNM 分期、浸润 深度以及淋巴结转移、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分 化程度等指标均能够反映肿瘤生长和侵袭情况， DCLK1 可对肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达发挥调控 作用，对结直肠肿瘤凋亡可产生影响，同时也会影响化疗敏感度。贾长河等[14]研究发现，DCLK1 在胃 癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织 ， DCLK1 高表达与胃癌患者临床分期、淋巴转移、脉 管侵犯、神经侵犯以及肿瘤浸润程度、分化程度存 在相关性。

　　综上所述，肿瘤组织中 DCLK1 高表达水平影响 因素较多，包括淋巴结转移、浸润深度、TNM 分期、肿瘤直径、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度等，临 床可根据相关影响因素对 DCLK1 单克隆抗体表达 水平进行判断。本研究的局限性主要包括样本量 少和研究时间短等，未来应在条件允许的情况下增 加样本量并延长研究时间以深入验证和分析 DCLK1 单克隆抗体在结肠癌中的表达情况，以期为 临床评估患者病情与预后提供一定的指导。

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