摘要：猫的AB型血型系统由A型、B型和AB 3种血型组成。配型不合可能导致急性溶血性输血反应和新生儿溶血。根据TaqMan探针荧光定量分析原理，通过对猫血型决定基因胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟基酶（CMAH）基因的4个血型相关的位点进行序列比对，设计相应引物以及探针，建立猫血型荧光PCR检测方法。该研究建立的猫血型荧光PCR检测方法与商品化的血型检测试纸条检测结果符合度达100%。此外，研究发现在北京及周边地区采集的269个猫样本中，A型血型占94.05%、B型占5.58%、AB型占0.37%。

　　关键词：猫血型,CMAH基因,基因型检测,荧光PCR

　　Establishment and Application of Real-Time PCR for Detection of Feline Blood Type

　　ZHAO Fangyuan，GONG Yujie，ZHAO Rongmao，DENG Xi，BI Mingyu

　　（Beijing Nabai Biotechnology Co.Ltd，Beijing 102600，China）

　　Abstract：The AB blood type system in feline is composed of three blood types：A，B and AB．Mismatches may result in acute hemolytic transfusion reactions and neonatal isoerythrolysis．According to the principle of TaqMan probefluorescence quantitative analysis。four sites of the feline blood type determining gene，cytidine-phospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase（CMAH）gene，were aligned，and the corresponding primers and probes were designed to establish a real-time PCR detection method for feline blood type．The real-time PCR method for feline blood type detection established in this study was 100%consistent with the results of Alvedia rapid-test（LabTest A+B）．In addition。in the 269 feline samples collected in Beijing and surrounding areas，the proportions of A，B and AB blood type were 94.05%，5.58%and 0.37%，respectively.

　　Keywords：Feline blood type，CMAH gene，Detection of genotypes，real-time PCR

　　0引言

　　猫的AB型血型系统由A型、B型和极其罕见的AB型组成[1]。该系统具有非常重要的临床意义，因为血液不相容可能导致急性溶血性输血反应和新生儿溶血（Neonatal Isoerythrolysis，NI）[2]。B型猫的胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟基酶（CMAH；EC 1.14.18.2）编码基因发生基因突变，该突变会抑制猫体内的胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸（NeuAc；B型抗原）转化为N-羟基神经氨酸（NeuGc；A型抗原），而A型猫胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟基酶活性正常[3]。猫的AB型血型系统的遗传模式由1组3个等位基因A、c、b调节；在A存在时c和b完全隐性，在c存在时b完全隐性[4]。在A型猫中可以观察到A/A、A/b和A/c 3种基因型，在B型猫中可以观察到b/b，在C型猫中可以观察到c/c和c/b型[5-6]。

　　目前，已有文献表明，某些CMAH基因位点变异被认为可能会导致A型抗原所需的正常CMAH活性丧失或降低，进而导致B型和AB型血的出现。在2007年，Bighignoli B等[4]发现多个突变位点，其中包括c.179G＞T，c.268T＞A。之后Gandolfi B等[7]认为c.364C＞T的突变可能与AB型血的形成有关。最后，Kehl A等[6]发现CMAH的c.179G＞T，c.1322delT突变与b基因存在密切关联型。根据报道的突变位点的出现频率，本研究以c.179G＞T，c.268T＞A，c.364C＞T，c.1322delT单核苷酸变异位点为检测靶点，设计了荧光PCR的引物及探针并建立了猫血型荧光PCR检测方法。确定猫血型荧光PCR的检测性能后，针对269只于北京市及周边地区收集的猫血及猫口腔拭子样本进行检测，分析所收集的样本血型分布情况。

　　1材料与方法

　　1.1样本来源

　　样品为北京及周边地区多家宠物医院采集的猫口腔拭子和EDTA全血，样本于-20℃保存。收集猫EDTA全血时，同时收集口腔拭子样本。收集的新鲜猫EDTA全血使用Alvedia快速检测试剂盒（LabTestA+B）确定血型后，进行保存。

　　1.2主要试剂与设备

　　磁珠法核酸提取试剂盒（北京纳百生物科技有限公司），2×HyperProbe Mixture（康为世纪），鲲鹏Archimed-X6荧光定量PCR仪。

　　1.3试验方法

　　1.3.1样品总核酸的提取

　　按照磁珠法核酸提取试剂盒说明书进行操作。
       1.3.2猫血型PCR检测方法的建立

　　（1）引物和Taqman探针设计。根据NCBI网站上可查询的猫血型决定基因CMAH的4个单核苷酸突变位点（179G＞T，268T＞A，364C＞T，1322delT）及上下游核酸序列，采用primer 5.0软件，设计出如表1所示的特异性引物及Taqman探针。

　　（2）反应体系的配置。每个样本需要同时进行8孔独立的荧光PCR反应，其中反应液中上、下游引物及探针浓度为10μmol/L，具体配置见表2。

　　（3）反应程序的设置。根据表3设置PCR扩增程序。

　　（4）PCR扩增及结果判读。提取后的核酸分别在每个孔中添加5μL，按照表3中的程序进行扩增。根据每个孔是否有扩增曲线、Ct值以及ΔCt的大小判定4个SNP位点的基因型，若同一位点的2个孔的Ct值接近(ΔCt≤5），则认为既有野生型也有突变型，为杂合型；若2个孔中有1个孔无扩增曲线，则认为有Ct值的孔位为纯合型；若2个孔的ΔCt值＞5，则认为该位点相应小的Ct值孔位的基因型为纯合型，见表4。最后根据4个位点的基因型并对照表5判定猫的血型。

　　1.4样本检测

　　用本研究建立的猫血型荧光PCR检测方法检测收集样本，并统计所有检测样本的基因型与血型。

　　2结果与分析

　　经过猫血型荧光PCR检测，110份EDTA全血样本与其对应的口腔拭子样本的血型及基因型均一致，并且与Alvedia快速检测试剂盒检测结果符合度达100%，这说明本研究建立的猫血型荧光PCR检测不仅可以检测血液样本还可以检测猫口腔拭子样本，并且基因与表型的相关性高。因此，本研究成功建立了猫血型荧光PCR检测方法。

　　此外，如表5所示，在收集的269个样本中，有94.05%的样本为A型血，该血型占据了主导地位，5.58%的样本为B型血，AB型血则非常稀少，仅有1例，占总样本数的0.37%，其基因型为c/b。

　　3讨论

　　本研究以c.179G>T，c.268T>A，c.364C>T，c.1322delT单核苷酸变异位点为检测靶点，建立了猫血型荧光PCR检测技术，目前所检测样本的结果显示基因与表型高度符合。考虑到随着样本数量的放大，可能存在本研究中的4个突变位点之外的其他引起CMAH酶失活的突变位点，因此B型血猫中导致CMAH活性缺失的更多基因突变位点还需要更多研究。

　　当前有关猫血型分布情况在国内还鲜有报道，本研究通过猫血型荧光PCR检测方法，分析北京市及周边地区收集的猫样本的血型。共检测了269个样本，发现A型血型占94.05%、B型占5.58%、AB型占0.37%，这与其他地区的猫血型分布结果类似，A型是猫的主要血型，B型血占比次之，而AB型的猫非常稀少[8]。与其他研究相比，本研究中检测到的B型血的比例相对较低。在一些欧洲国家，如法国和意大利，已经报道了B型猫的频率为10%～15%[9]。并且Kehl A[6]等发现英国短毛猫中B型血的比例可以达到25%，而缅因猫的B型血的比例仅为1%。这可能说明了不同的地区以及不同的品种间，猫的血型分布具有差异。此外，在B型血中纯合的268位A等位基因是最主要的基因型[6]，这与本研究的结果一致。而在A型血猫中，基因型为A/A的比例约为A/b的2.5倍，这可能是他们的检测样本中缅因猫占比大（约45%）导致。AB型血型很少的情况与大多数研究的报道相似。因为只有当B型猫占猫科动物种群的相当大比例时，才有可能出现AB型猫[8]。了解猫血型的分布情况具有一定的临床意义，为输血治疗和计划育种提供了参考数据。

参考文献

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　　[2]郑兰，何小凤，钟友刚，等．猫的血型概论[J]．中国兽医杂志，2009，45（3）：65-66.

　　[3]Andrews G A，C have y P S，Smith J E，et al.　N-glycolylneuraminic acid and N-acetylneuraminic acid define feline blood group A and B antigens[J]．Blood，1992，79（9）：2 485-2 491.

　　[4]Bighig no li B，Ni in i T，Grahn R，et al．Cyti dine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase（CMAH）mutations associated with the domestic cat AB blood group[J].BMC Genetics，2007，8：27.

　　[5]Griot-wenk M E，Giger U．Feline transfusion medicine．Blood　types and their clinical importance[J]．The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice，1995，25（6）：1 305-1 322.

　　[6]Kehl A，Mueller E，Giger U．CMAH genotyping survey for blood types A，B and C（AB）in purpose-bred cats[J].Animal Genetics，2019，50（3）：303-306.

　　[7]GandolfiB，Grahn R A，Gustafson N A，et al．Correction：A Novel Variant in CMAH Is Associated with Blood Type AB in Ragdoll Cats[J]．PLoS One，2018，13（3）：e0 194 471.

　　[8]Zheng L，Zhong Y G，Shi Z S，et al．Frequencies of blood types A，B，and AB in non-pedigree domestic cats in Beijing[J].　Veterinary Clinical Pathology，2011，40（4）：513-517.

　　[9]Giger U，Gorman N T，Hubler M，et al．Frequencies of feline A and B blood types in Europe[J]．Proceedings of the International Society of Animal Genetics Conference，1992，23：17-18.