摘要：该文对CTIF在胚胎发育过程中的表达进行初步研究。通过设计特异性扩增W拷贝、Z拷贝以及同时扩增W和Z拷贝的引物（CTIF-W、CTIF-Z及CTIF-ZW），对其在胚胎的不同日龄的组织的mRNA表达量进行分析，并通过FAD（fadrozole）诱导性反转探索其对性别表型的响应。结果显示，CTIF-W在孵化6 d的胚胎性腺中的表达高于尾部，且随胚胎发育表达量逐渐升高，而CTIF-Z和CTIF-ZW的表达趋势相似；而在6 d鸡胚的其他组织中，CTIF-ZW在肾中的表达显著高于其他组织，说明CTIF在发挥某些基础功能的同时可能还与肾脏的发育或功能相关。CTIF-Z在多数组织中表达量均呈现出雄性高于雌性，而CTIF-ZW在雌雄之间的表达量差异则相对较小，表明W拷贝可能在一定程度上调控了雌性中Z拷贝的表达。CTIF-W和CTIF-Z在12 d的胚胎组织中均表达，且均高度表达于脾脏组织中；CTIF-Z在大多数组织中雄性表达高于雌性。此外，CTIF-W表达受雌性向雄性性反转的影响而显著降低，而CTIF-Z则没有响应。综上，CTIF在鸡胚的肾脏和脾脏中高度表达，且其Z拷贝在雌雄组织之间存在剂量效应，而W拷贝可能在雌性中作为Z拷贝的补偿以保证其生物学功能的发挥。

　　关键词：鸡胚,W染色体基因,CTIF,表达模式,功能研究

　　Study on the Expression of Chicken W Chromosome Gene CTIF in Chicken Embryo Tissues

　　ZHENG Hongxiang

　　（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou Jiangsu 225009，China）

　　Abstract：In this paper，the expression of CTIF during embryonic development was studied．By designing primers（CTIF-W，CTIF-Z and CTIF-ZW）that specifically amplify W and Z copies and simultaneously amplify W and Z copies，the mRNA expression levels of W and Z copies in different day-old tissues of embryos were analyzed，and the response to gender phenotype was explored by FAD（fadrozole）induced reversal．The results showed that the expression of CTIF-W in the gonads of embryos at 6 days of incubation was higher than that in the tail，and the expression level gradually increased with embryonic development，while the expression trend of CTIF-Z and CTIF-ZW was similar．In other tissues of 6-day-old chicken embryos，the expression of CTIF-ZW in kidney was significantly higher than that in other tissues，indicating that CTIF may also be related to the development or function of kidney while exerting certain basic functions．The expression of CTIF-Z in most tissues was higher in males than in females，while the expression difference of CTIF-ZW between males and females was relatively small，indicating that W copy may regulate the expression of Z copy in females to a certain extent．Both CTIF-W and CTIF-Z were expressed in 12-day embryonic tissues and were highly expressed in spleen tissues.The expression of CTIF-Z in male was higher than that in female in most tissues．In addition，the expression of CTIF-W was significantly reduced by the effect of female-to-male sex reversal，while CTIF-Z did not respond．In summary，CTIF is highly expressed in the kidney and spleen of chicken embryos，and its Z copy has a dose effect between male and female tissues，while W copy maybe used as a compensation for Z copy in female to ensure its biological function.

　　Keywords：Chicken embryo，W chromosome gene，CTIF，expression profile

　　0引言

　　目前研究表明，对鸡的性别决定机制的看法，更多的还是倾向于Z染色体的剂量效应和W染色体的显性效应假说[1-2]。有关研究对雌雄同体鸡和实验嵌合体的分析表明，鸡的性表型至少在一定程度上是细胞自主的，在不同的组织和不同的阶段出现了性二型基因表达。事实上，W似乎含有少量与性发育无关的基因，但由于它们是剂量敏感因素而被保留了下来。由于鸟类缺乏Z的整体剂量补偿，Z连锁基因可能在不同组织中指导性别发育（雄性平均表达量是雌性的1.5～2倍）。在胚胎性腺中，Z-linked DMRT1基因在睾丸发育中起着关键作用。除了性腺之外，其他的Z-连锁基因组合可能也控制着性发育，以及性类固醇激素的作用[3]。鸡的细胞自主性别决定的证据来自侧性雌雄同体的研究，以及先于性腺分化的性二型基因表达。推测在鸡的W染色体上发现的一个或多个广泛表达的调控因子可能已经进化到在整个身体的细胞类型中直接决定雌性命运的各个方面[4]。

　　CTIF基因的全名是帽结合复依赖翻译起始因子，其基因类型属于蛋白质编码基因。CBP 80/CBP 20复合物参与同时编辑和翻译步骤，识别mRNAs中的过早终止密码子（PTCs）并引导含PTC的mRNAs走向无意义介导的衰变（NMD）。在没有PTC的mRNAs上，cpp 80/cpp 20复合物被替换为细胞质mRNA帽结合蛋白，包括eifg（Mim 600495）和细胞质中mRNAs的稳态翻译[5-7]。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　试验所用的海兰褐蛋鸡商品代种蛋，在37.5℃和60%湿度的条件下孵化至6 d（E6）和12 d（E12），分别采集孵化6 d的肝脏、肾脏、大脑、腿肌、心脏、胃、尾和性腺以及除此以外的中肾、脾脏、胸肌、肌胃、腺胃和十二指肠等组织12 d的样（公母各6个重复），后用液氮快速冷冻，存于-80℃备用。

　　1.2试验方法

　　1.2.1使用芳香化酶抑制剂（FAD）诱导性反转

　　用FAD处理孵化2.5 d的鸡胚并采集12 d的性腺组织，分为对照组和处理组，具体方法参照Liu L[8]。

　　1.2.2样本的性别鉴定

　　家禽性别由性染色体W和Z决定，雌性为ZW型，雄性为ZZ型。CHD基因在性染色体Z染色体和W染色体上均存在，本方法根据该基因的某段序列在性染色体Z和W上的大小差异，设计出一对引物。利用该对引物对所提取出的基因组DNA进行扩增，并对扩增产物进行克隆测序验证以及琼脂糖凝胶电泳的步骤，结果表明扩增序列为CHD基因的目的片段；因为电泳条带差异明显，所以根据条带数的不同可以明确区分鸡的性别[9]。

　　引物设计情况，见表1。体系：25μL。上下游引物各1μL、DNA模板2μL、MIX 12.5μL、水8.5μL。PCR反应程序为94℃运行5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃10 min，4℃保存。得到PCR产物后用2%琼脂糖凝胶电泳40 min左右。

　　根据电泳条带的数目分析公母的结果。2个明显条带的为母鸡，而有1个单一条带的为公鸡，条带清晰，见图1。

　　1.2.3样本DNA的提取

　　DNA的提取采用试剂盒的方法（TIANamp Genomic DNA Kit），之后放-20℃冰箱待用。

　　1.2.4引物的设计

　　查找Ensembl数据库中CTIF基因在性染色体上的序列信息，设计了W染色体、Z染色体和性染色体上共有序列的特异性扩增引物（CTIF-W、CTIF-Z及CTIF-ZW）。引物序列，见表2。

　　1.2.5 RNA的提取和cDNA的合成

　　采用天根公司的TRNzol Universal总RNA提取试剂（DP424）提取组织总RNA；采用诺唯赞的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂合成cDNA，后放于-20℃备用。

　　1.2.6荧光定量PCR分析

　　表2中的引物由金唯智公司合成，后使用诺唯赞的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒检测CTIF基因在各组样本中的表达量。QPCR体系和反应条件见参考文献[8]。采用2﹣△△Ct方法计算基因的相对表达量。

　　1.2.7数据分析

　　使用Ecxel对原始数据进行整理和t检验，P＜0.05表示差异显著。　
   　2结果分析

　　2.1孵化6 d和12 d鸡胚性腺和非性腺（尾部）组织中CTIF基因在mRNA水平上的表达情况

　　无论是6 d还是12 d样，CTIF-W在性腺的表达显著高于尾部，其在性腺中的表达量随着鸡胚发育逐渐升高（图2A）；CTIF-ZW与CTIF-Z的表达模式相似（图2B、2C），在6 d样本的同性别中尾部的表达显著高于性腺，至12 d雌性性腺的表达又高于尾部而雄性性腺表达显著低于尾部。

　　2.2孵化6 d鸡胚7个组织中的CTIF基因在mRNA水平上的表达情况

　　CTIF-ZW在肾脏的表达量显著高于其他组织，且CTIF-Z在多数组织中的表达量均表现出雄性高于雌性（图3B），但CTIF-ZW的表达量在雌雄之间的差异则相对较小，只有在肾组织中雄性显著高于雌性（图3C）。

　　2.3孵化12 d鸡胚11个组织中的CTIF基因在mRNA水平上的表达情况

　　在12日龄的所有组织中CTIF基因的Z染色体和W染色体拷贝均有表达（图4A),且脾脏中CTIF-W的表达显著高于生殖腺以外的其他组织（图4A）。在大多数组织中，CTIF-Z都表现为雄性高于雌性（图4B），而CTIF-ZW的表达量在雌雄之间的差异相对较小（图4C）。

　　2.4 CTIF基因在雌性向雄性性反转的性腺中的表达情况

　　在药物性逆转模型中，雌性向雄性逆转组性腺中CTIF-W的表达与WT对照组相比显著降低（图5A）；CTIF-Z和CTIF-ZW组间差异分析显示，Z染色体上的表达水平显著降低，W染色体上的表达水平降低，但不显著（图5B和图5C），总表达量显著降低。

　　3讨论

　　在雌雄异体的物种中，对于性别决定起关键作用的往往是性染色体基因[1-2]。

　　本研究结果表明，CTIF基因在胚胎发育过程中广泛表达于12个组织中，尤其在第6天的肾脏和第12天的脾脏中表达水平较高。同样，在雌雄性逆转的性腺中，CTIF-W的表达与对照组相比显著降低（图5A），表明W的拷贝表达与性别表型有关。分析CTIF-Z和CTIF-ZW在各组内的差异，发现在Z染色体上的表达量显著降低，而在W染色体上的表达量降低但不显著。总体而言，CTIF-W的总表达量显著下降，表明CTIF-W可能参与雌性性腺的分化或发育，而CTIF-Z可能具有其他基本功能。

　　值得注意的是，对CTIF在孵化12 d胚胎组织中的进一步表达分析发现，CTIF-W在脾脏和CTIF-ZW在肾脏中的表达显著高于其他组织（图4A、4C），提示其可能参与了肾脏和脾脏的发育或相关功能。此外，CTIF-Z在多数组织中表达量显示出雄性高于雌性，这可能是因为鸟类Z染色体缺乏类似于哺乳动物X染色体失活的整体性的体剂量补偿[10-14]。另外，对比CTIF-Z和CTIF-ZW在各组织中的表达量发现，CTIF-ZW在多数组织的雌雄之间表达差异相对较小，这与前人所发现的“大部分W基因是在进化过程中被保留下来的用以补偿Z染色体拷贝”的观点一致[15]。不过本试验结果表明，CTIF-Z在雌性和雄性的性腺中表达量基本一致，表明这些组织的CTIF-Z的表达中存在某个调控雌雄之间表达量的机制，因而雌雄间的表达量无显著差异。CTIF在鸡胚不同组织中的不同补偿机制还有待进一步研究。

　　4结论

　　本研究结果表明，鸡W染色体上基因CTIF在胚胎发育过程中的12个组织中呈现广谱表达，尤其在6 d的肾脏和12 d的脾脏组织中观察到高水平表达。值得注意的是，其Z染色体拷贝在不同组织和性别之间表现出不同程度的剂量效应，而W染色体拷贝可能在雌性个体的某些组织中作为Z染色体拷贝的补偿，以确保适当的生物学功能。

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