摘要：该试验旨在筛选具有高产蛋白酶能力的益生芽孢杆菌，扩大微生态制剂候选菌株资源。以边鸡直肠内容物为分离来 源，经脱脂奶粉平板初筛获得16株产蛋白酶菌株，液体发酵复筛后，选取1株蛋白酶活力高达119.7 U/mL的芽孢杆菌FRE76 进行后续研究。通过16S rRNA基因测序与进化树分析，并结合形态学与生理生化鉴定，判定该菌株为枯草芽孢杆菌。病 原菌抑制试验表明，该菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。耐酸和耐胆盐检测发现，在pH值3.0和4.0时 该菌株存活率均为50%以上，在胆盐浓度为0.1%和0.3%时菌株存活率均能达到60%以上。该试验筛选获得的枯草芽孢杆菌 FRE76.具有优良的蛋白酶生产性能、较好的致病菌抑制能力和较强的抗逆性，是一株潜在的益生菌菌株。

　　关键词： 益生菌,枯草芽孢杆菌,分离鉴定,蛋白酶,生物学特性

　　0 引言

　　抗生素的过度使用也带来一系列的问题。畜禽产品中抗饲用抗生素对畜禽养殖业的发展做出突出贡献，但 生素残留、畜禽体内肠道微生物菌群紊乱、畜禽机体的免疫力降低、细菌菌株耐药性增加、环境污染等[1] 。为 解决饲用抗生素引起的食品安全与环境污染等问题， 1986年以来，瑞典、欧盟、丹麦、瑞士等国先后出台相 关政策，禁止在饲料中添加抗生素生长促进剂。我国也 于2020年7月1 日开始全面实施禁止促生长抗生素在饲料 中的使用。禁用饲用抗生素给畜牧业的发展带来了一定 挑战，但却有效保障畜禽产品安全，也为绿色无污染的 抗生素替代品的快速研发与应用提供重要机遇。

　　芽孢杆菌具备产酶种类丰富、可以产生多种活性代 谢产物和抗逆性强等特点，是十分重要的益生菌资源， 也是目前替抗添加剂的研究热点[2] 。益生芽孢杆菌饲喂 畜禽后，可以维持畜禽肠道菌群平衡，提高饲料利用 率，改善畜禽的生产性能，增强畜禽免疫能力[3] 。益生 芽孢杆菌除直接饲喂畜禽外，还可以通过发酵处理获得 营养价值更加丰富的生物发酵饲料。饲养试验表明，生 物发酵饲料可以显著提高猪、肉鸡、肉牛等畜禽的养分 消化率和日增重，实现经济效益最大化[4-6] 。益生芽孢杆 菌在抗生素替代方面具有广阔的发展前景，因此，筛选 功能性益生芽孢杆菌并了解其生物学特性，对今后替抗 产品的开发具有重大意义。蛋白酶作为一类重要的水解 酶，其在食品、饲料、医药、纺织等领域均有广泛应 用[7] 。芽孢杆菌是工业用蛋白酶重要来源之一[8] ，筛选 高产蛋白酶益生芽孢杆菌，拓展益生菌种类资源，具有 重要的理论意义和生产价值。本研究计划从边鸡直肠肠 道内容物中筛选高产蛋白酶益生芽孢杆菌，并对其产酶 性能、生理生化特性、抑菌性能和抗逆性进行分析，为 今后其在畜禽养殖中的应用奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 样品采集

　　样品采集自阳泉市平定县张庄镇边鸡散养厂35周龄 健康边鸡，边鸡现场屠宰后取直肠内容物至5 mL无菌离 心管中，短时间内带回实验室进行后续分离试验。

　　1.2 测试用病原微生物

　　致病性大肠杆菌( Escherichia coli )、金黄色葡 萄球菌( Staphylococcus aureus )和副伤寒沙门氏菌 (Salmonella paratyphi )均购自北纳微生物及细胞资源 保藏中心。

　　1.3 培养基

　　LB培养基 (液体)：酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、 氯化钠10 g/L，定容后121 ℃灭菌20 min。

　　LB培养基(固体)： LB液体培养基中添加1.8%琼 脂粉，121 ℃灭菌20 min。

　　脱脂奶粉固体培养基：配制30 mL 15%脱脂奶粉， 115 ℃灭菌30 min。配制270 mL LB固体培养基， 121 ℃ 灭菌20 min 。将两者混合摇匀后，倒平板备用。

　　发酵培养基： 豆饼粉2.0%、玉米粉2.0%、葡萄糖0.5%、氯化钠0.2%、蛋白胨0.2%、磷酸氢二钾0.15% 、 磷酸二氢钾0.15% 、硫酸铵0.15%、硫酸镁0.06%、氯化 钙0.03%、吐温80 0.03%、硫酸锰0.01%。

　　耐酸性培养基：用稀盐酸将LB液体培养基的pH值 调整至2.0 、3.0和4.0 ，121 ℃灭菌20 min。

　　耐胆盐培养基：在LB液体培养基中分别加入0.1%、 0.3%和0.5%的猪胆盐， 115 ℃灭菌30 min。

　　1.4 菌株的分离纯化

　　在无菌环境下称取1 g直肠内容物放置于9 mL无菌生 理盐水中，用旋涡混匀器对其振荡处理。将混匀后的样 品置于90 ℃的水浴锅中处理10 min ，取出样品，待其冷 却后梯度稀释，吸取稀释倍数为 10 -6 、 10 -7 和10-8 的样 品各1 mL涂布于1%脱脂奶粉平板上， 37 ℃静置培养 48 h。将产生明显水解圈的菌株在LB固体平板上划线分 离纯化3代，得到纯种菌株。

　　1.5 菌株蛋白酶活力分析

　　脱脂奶粉表型平板观察。吸取2 μL活化后的菌液接 种于脱脂奶粉表型平板上，静置培养72 h 。取出平板， 用量尺量出菌落与蛋白降解圈直径并做好记录。

　　蛋白酶活力测定。取2 mL活化后菌液接种至100 mL 发酵培养基中， 37 ℃ , 200 r/min震荡培养。在设定的时 间点取样，离心后取上清作为粗酶液。蛋白酶活力测定 参考Lowry O H等[9]福林酚酶活测定法。酶活力单位定义 为在39 ℃条件下， 1 min内1 mL酶液水解酪蛋白产生 1 μg酪氨酸的量，为1个酶活单位(U)。

　　1.6 形态学鉴定

　　取2 μL菌液接种于LB固体培养基上， 37 ℃静置 培养48 h，观察记录菌落形态。挑取菌落的菌体制作 涂片，并进行革兰氏染色，于油镜下观察菌体的形态 特征。

　　1.7 生理生化鉴定

　　参照《伯杰细菌鉴定手册》 [10]和《常见细菌系统鉴 定手册》 [11]进行V-P试验、硝酸盐还原、触酶、吲哚试 验、明胶液化、糖类酸化与利用，以及糖苷水解酶产生 等试验。

　　1.8 16S rRNA测序分析

　　利用细菌基因组提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公 司)对细菌基因组进行提取，并以基因组为模板， 用通 用引物27F( 5 ′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′) 和1492R( 5 TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ′) 进行16S rRNA基因扩增。将扩增得到的目的基因片段 切胶回收后，与pMD19-T载体连接后，送至生工生物 工程(上海)股份有限公司进行测序。 16S rRNA基因 序列信息上传至EzBioCloud( http://www.ezbiocloud. net)进行同源性分析，并下载近缘物种16S rRNA基因 序列。用MEGA 11软件进行序列比对与系统发育树构建(Neighbor-joining)。

　　1.9 抑菌能力分析

　　病原菌抑制性分析采用牛津杯法。取1 mL活化后的 病原菌菌液( 108 CFU/mL)加入到100 mL LB液体培养 基中， 充分混合均匀，倒入放有牛津杯的无菌平板内。 待培养基冷凝后，取出牛津杯，将100 μL无菌体上清液 (试验组)和生理盐水(对照组)分别加入到牛津杯留 下的空洞内， 37 ℃静置培养8 h ，测量抑菌圈直径。

　　1.10 耐酸能力分析

　　取0.1 mL菌悬液接种于0.9 mL耐酸性培养基中， 37 ℃ , 200 r/min震荡培养2 h 。将处理后的菌液进行梯度稀释， 并涂布于LB固体平板， 37 ℃静置培养24 h后，计算菌株 存活率。

　　1.11 耐胆盐能力分析

　　取0.1 mL菌悬液接种到0.9 mL耐胆盐培养基中， 37 ℃ , 200 r/min震荡培养2 h。取处理后的菌液进行梯 度稀释，并涂布于LB固体平板， 37 ℃静置培养24 h后， 计算菌株存活率。

　　2 结果

　　2.1 产蛋白酶菌株筛选

　　将肠道内容物高温处理后，进行梯度稀释，并涂布 于脱脂奶粉平板。经培养后，共发现有16株菌产生较为 明显的蛋白水解圈， 见图1.通过计算蛋白水解圈直径 (D)与菌落直径(d)的比值来初步判断菌株降解蛋白 能力的强弱。如图1所示，共有6株菌D/d的比值大于2 ， 其中菌株FRE76 D/d的比值最大，为2.75.

　　2.2 产蛋白酶菌株酶活力分析

　　为进一步分析菌株产蛋白酶能力，将D/d比值大于 2的菌株接种至产酶发酵培养基中，并对其进行蛋白 酶活力测定。由图2可知，菌株FRE76蛋白酶活力最高 ( 119.7 U/mL)，其次为菌株FRE78( 89.2 U/mL)和 FRE3( 82.7 U/mL)。菌株FRE61 、FRE53和FRE102的 蛋白酶活力均未达到20 U/mL，远低于以上3株菌的蛋白酶 活力。鉴于菌株FRE76蛋白水解圈比值最大，并且其蛋 白酶活力最高，因此选取其做进一步的鉴定与特性分析。

　　2.3 产蛋白酶菌株FRE76的形态学鉴定

　　菌株FRE76在LB固体平板上生长良好，菌落呈灰 白色偏黄，圆形，边缘有褶皱，表面干燥不平整，见图 3A 。显微镜镜检结果显示，菌株革兰氏染色呈蓝紫色， 为革兰氏阳性菌，菌体呈直杆状，不成链，见图3B。

　　2.4 产蛋白酶菌株FRE76生理生化鉴定

　　菌株FRE76生理生化鉴定结果表明，菌株V-P试 验、触酶以及硝酸盐还原为阳性，可以水解明胶，可 以利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖等，不产 生吲哚;具有酯酶( C4 )、类脂酯酶( C8 )、类脂酶 ( C14)活性，具有α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、 胰蛋白酶等，其他结果见表1.将上述鉴定结果与《伯 杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行对 照，结果发现该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

　　2.5 产蛋白酶菌株FRE76的分子生物学鉴定

　　将菌株 F RE76 16S rRNA 基因序列上传至 EzBioCloud进行比对分析，结果显示，菌株FRE76与 枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)NCIB 3610的相似度 最高，为99.86%。进化树分析结果显示，菌株FRE76 与枯草芽孢杆菌NCIB 3610形成一个独立小分支，亲 缘关系最近;这2株菌形成的小分支与芽孢杆菌属中卡 氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)TE3、龙舌兰芽孢杆 菌(Bacillus tequilensis )KCTC 13622、耐盐芽孢杆菌 (Bacillus halotolerans )ATCC 25096和螺旋芽孢杆菌 (Bacillus spizizenii)NRRL B-23049等菌株聚在同一 个大分支上，亲缘关系较近，见图4.在同源序列分析 的基础上，结合菌株FRE76的形态特征以及生理生化 特性，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，并命为枯草芽孢 杆菌FRE76.

　　2.6 枯草芽孢杆菌FRE76抑菌能力分析

　　通过抑菌试验可知，枯草芽孢杆菌FRE76上清液对 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，其抑菌圈直径分别为15 mm和21 mm ，见图5.但上清液对副 伤寒沙门氏菌没有抑制作用。以上结果说明，该菌株能 够产生抑制常见肠道致病菌的活性物质，并且该物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。

　　2.7 枯草芽孢杆菌FRE76耐酸能力分析

　　菌株FRE76在不同pH值下处理2 h后的存活率，见 图6.菌株FRE76在pH值2.0的极端环境下，其存活率较 低，仅为1.3%。随着pH值的升高，菌株FRE76的存活率 呈明显上升的趋势，在pH值3.0和4.0的条件下，其存活 率分别达到54.2%和71.3%。

　　2.8 枯草芽孢杆菌FRE76耐胆盐能力分析

　　菌株FRE76耐胆盐结果，见图7.随着胆盐浓度提 高，菌株存活率逐渐降低。在胆盐浓度为0.1%和0.3% 时，菌株存活率均能达到60%以上，在胆盐浓度为0.5% 时，菌株存活率仍在37.1%。以上结果说明枯草芽孢杆 菌FRE76具有较好的胆盐耐受能力。

　　3 讨论

　　从动物肠道中筛选益生菌株并将其添加到动物饲料 中，是一种常用并且高效的益生菌资源开发利用途径。 本次研究对象为边鸡，其原产于山西与内蒙古交接地 带，是山西本地鸡品种，具有抗病力强、耐寒、耐粗 饲、抗逆性强、觅食力强等特点[12] 。为筛选出性能优良 的益生芽孢杆菌，扩大可饲用益生菌资源库，本研究以 产蛋白酶作为筛选条件，从边鸡肠道内容物中筛选获得 16株产蛋白酶芽孢杆菌。经蛋白酶酶活力测定与菌种鉴 定分析，获得一株高产蛋白酶枯草芽孢杆菌FRE76.

　　自然界中产蛋白酶的微生物主要有细菌、丝状真菌 和放线菌，而细菌中的芽孢杆菌是产蛋白酶的主要菌 属[13]。研究表明，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆 菌、地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌在内的多种芽孢杆 菌均具有较好的蛋白酶生产能力[14] 。本研究获得的枯草 芽孢杆菌FRE76.其蛋白酶活力最高为119.7 U/mL，显 著高于大部分已报道的枯草芽孢杆菌蛋白酶活力[15-17] 。 李力等[15]从不同来源的10株枯草芽孢杆菌中筛选获得2 株蛋白酶活力相对较优的菌株，其蛋白酶活力最高为 39.4 U/mL。程德勇等[16]从土壤中筛选出20株产蛋白酶 芽孢杆菌，其中，枯草芽孢杆菌CDY-5蛋白酶活性最 强，为23.44 U/mL。刘晓艳等[17]从大豆及其发酵制品中 筛选获得一株蛋白酶活力为33.19 U/mL的枯草芽孢杆菌 菌株W1.此外， Soares V F等[18]报道枯草芽孢杆菌液体 发酵后蛋白酶活力为120 U/mL，岳寿松等[19]等从家禽养 殖场废弃堆积物中分离的枯草芽孢杆菌SDTB-1最高酶 活力达到152.2 U/mL，均高于本次筛选获得的枯草芽孢 杆菌菌株FRE76.为进一步提升菌株FRE76产蛋白酶能 力，增强其应用潜力，后续可以对该菌株进行诱变育种 或遗传改造，并对培养条件进行优化。

　　益生芽孢杆菌对致病菌的拮抗作用是评价其有效性 的重要依据。畜禽肠道中最常见的致病菌主要有大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌。本试验中筛选 获得的枯草芽孢杆菌FRE76对大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌均有较明显的抑制作用，其中，对后者的抑制作用更 强。本试验结果与先前报道结果相似， Lu Z等[20]研究发 现，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有 较好的抑制效果。齐鹏飞等[21]筛选获得的枯草芽孢杆菌 LV1和LV2对金黄色葡萄球菌有十分明显的抑制效果。 良好的抑菌性能为枯草芽孢杆菌更好的发挥益生性能奠 定了基础。

　　良好的抗逆性对于益生菌充分发挥其益生作用非常 关键，动物胃肠道内环境特殊，需要益生菌有一定的耐 酸能力和耐胆盐能力。本次试验从边鸡直肠内容物中 筛选获得的枯草芽孢杆菌FRE76. 在pH值3.0时存活率 为54.2% ，pH值4.0时存活率则达到71.3%;在胆盐浓度为0.1%和0.3%时，菌株存活率均能达到60%以上。菌株 FRE76较强的耐受能力为其在动物胃酸环境和肠道环境 中稳定存活提供有力保障，并为其发挥益生特性创造良 好条件。

　　4 结论

　　本试验以边鸡直肠内容物为材料，分离并鉴定出 1 株高产蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株FRE76.该菌株最高 蛋白酶活力为119.7 U/mL，对大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌均具有明显的抑制作用，具有良好的耐酸能力和耐胆 盐能力，是一株潜在的微生态制剂候选菌株。

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