摘要：文章集中研究马尾连对变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）的体外抑菌活性。结果显示，马尾连对Smutans的抑菌圈大小为14.78±0.46 mm，最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为7.81 mg/mL和31.25 mg/mL，对S.mutans表现出显著的抑菌活性。当马尾连质量浓度≥1.95 mg/mL时，其对S.mutans的黏附作用抑制显著；当马尾连质量浓度≥0.98 mg/mL时，其对S.mutans的产酸作用有不同程度的影响；当马尾连质量浓度≥1.95 mg/mL时，能显著抑制S.mutans生物膜形成量。马尾连对S.mutans具有显著的抑制及杀灭作用，并对S.mutans的黏附、产酸和生物膜形成量有不同程度的抑制作用。

　　关键词：马尾连；变异链球菌；生物膜；体外抑菌活性

　　龋病是一种常见的慢性、感染性口腔疾病。变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）作为龋病的主要致病菌，主要通过黏附于牙齿表面，代谢糖类产生酸性物质。其产酸、耐酸特性是导致龋病发生的主要因素[1]。已有研究[2]表明，马尾连具有较好的抗菌活性，但其对S.mutans的体外抗菌效果尚未见报道。本研究在体外测定马尾连对S.mutans抗菌作用的相关指标，综合评估马尾连对S.mutans的抑菌效果，为马尾连在口腔领域的应用提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1主要试剂与仪器

　　马尾连，大豆酪蛋白琼脂（TSA）培养基，胰酪大豆胨液体（TSB）培养基，麦氏比浊管，结晶紫染色液，pH计，全波长多功能酶标仪。

　　1.1.2菌株

　　变异链球菌（S.mutans ATCC 25175），购自广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）。

　　1.2方法

　　1.2.1马尾连药液的制备

　　称取马尾连干药材100 g，放入烧杯中用蒸馏水浸泡2 h。先用大火煮沸，后立即调为小火，煎煮30 min。煎煮结束，将药液倒入另一个烧杯，向原药材中加入适量蒸馏水进行第二次煎煮。合并2次药液，加热浓缩至100 mL，得到质量浓度为1 000 mg/mL的马尾连药液。待药液冷却，过滤、分装、保存，供后续实验使用。

　　1.2.2菌悬液的制备

　　将复苏后的S.mutans于TSA培养基上传代，37℃厌氧培养24 h，用麦氏比浊法将菌悬液浓度调整为1×106个/mL，备用。

　　1.2.3 S.mutans对马尾连敏感性的测定

　　本实验采用药物敏感试验纸片扩散法（K-B法）[3]测定S.mutans对马尾连的敏感性。用无菌棉拭子蘸取菌悬液，挤掉多余液体，在TSA平板上从顶部到底部密集划线，转动平板60°继续划线，重复2次，用棉拭涂布平板边缘。平板划线结束后，将平板置于室温下3～5 min。用无菌镊子将药敏纸片和对照纸片贴于平板不同位置，轻压纸片，静置3 min，放入装有厌氧产气包的袋中，于37℃培养箱中厌氧培养24 h。

　　培养结束后，测量并记录抑菌圈大小，用直径（单位：mm）表示，重复3次取平均值。细菌对药物敏感性的判断标准参考文献[4]，即当抑菌圈直径>20 mm时，判断为极度敏感；在15～20 mm范围内，判断为高度敏感；在10～15 mm间，判断为中度敏感；直径<10 mm时，判断为低度敏感；直径为0 mm时，判断为不敏感。

　　1.2.4 MIC和MBC的测定

　　采用试管二倍稀释法测定MIC[3]。取试管1支，用TSB培养基稀释马尾连药液，使其质量浓度为250 mg/mL。另取试管10支，依次编号为1～10，将药液继续稀释为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95和0.98 mg/mL。往各实验组中加入800μL药液和40μL菌悬液。9号管作为阴性对照管（TSB+细菌悬液，不加药液)，10号管作为空白对照管（只加TSB培养基），每组3个重复，于37℃厌氧培养24 h。以肉眼未见细菌生长的最低药物浓度为马尾连的MIC。MIC大小与药物抑菌活性呈负相关，即MIC越小，药物抑菌活性越强，细菌对该药物的敏感性越高，反之亦然。

　　采用涂布平板法测定MBC。基于MIC实验结果，将无细菌生长、澄清透亮的试管内细菌培养液均匀涂布于TSA平板上，每组3个重复。在厌氧条件下，37℃培养箱中培养24 h。以肉眼未见菌落生长的最低药物浓度为中药马尾连的MBC[5]。MBC结果与药物的杀菌能力呈负相关，即MBC越小，药物对细菌的杀菌作用越强。

　　1.2.5黏附作用的测定

　　采用试管黏附法测定马尾连对S.mutans黏附作用的影响，结果以黏附抑制率（%）表示。取6支试管，各加入800μL药液，确保浓度≤MIC（7.81、3.91、1.95、0.98和0.49 mg/mL），分别向各管加入40μL菌悬液，另设加入等体积的TSB培养基作为阴性对照组，每组3个重复。于37℃厌氧培养24 h，取出并弃掉试管内的溶液，用1.2 mL的PBS缓冲液洗涤试管壁，重复3次。以3 500 r/min转速离心

　　15 min，弃上清，加入1.2 mL的PBS，吹打混匀后各吸取200μL溶液加入96孔板，用酶标仪测量其在630 nm波长处的吸光度（OD630值），重复测定3次。黏附抑制率（%）=（阴性对照组OD值-实验组OD值）/阴性对照组OD值×100%[6]。

　　1.2.6产酸作用的测定

　　菌悬液的使用浓度参照1.2.5。向实验组中加入2 mL各浓度药液和100μL菌悬液，对照组仅加入2 mL TSB培养基和100μL菌悬液，每组3个重复。使用酸度计测定初始pH后，在37℃厌氧培养24 h。培养结束后，以3 000 r/min转速离心15 min。分别取实验组和阴性对照组的上清液并测定其pH，以pH变化评价马尾连对S.mutans产酸作用的影响。ΔpH=初始pH-终末pH[7]。

　　1.2.7生物膜形成量的测定

　　采用结晶紫染色法测定MIC、1/2MIC和1/4MIC 3种浓度下药液对S.mutans生物膜形成量的影响，结果用抑制率（%）表示。

　　采用96孔酶标板，向实验组各孔内加入150μL TSB培养基、50μL菌悬液和50μL药液，阴性对照组加入150μL TSB培养基、50μL菌悬液和50μL蒸馏水，每组3个重复，于37℃厌氧培养24 h。取出，倒掉管内液体，用蒸馏水漂洗2次，结晶紫染色10 min；再用蒸馏水洗涤2～3次，加入260μL的33%乙酸溶液洗脱30 min，吸取200μL的乙酸洗脱液于新96孔板，测定630 nm处的吸光度（OD630值），并计算生物膜形成量的抑制率。抑制率（%）[8]=（Ac-At）/Ac×100%（式中：Ac为阴性对照组OD值；At为实验组OD值）。

　　1.2.8统计学分析

　　采用SPSS 26.0软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示。2组数据的比较采用独立样本t检验进行统计学分析，多组数据比较采用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义（P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示）。

　　2结果

　　2.1 S.mutans对马尾连的敏感性

　　用游标卡尺测量马尾连作用于S.mutans的抑菌圈大小（见图1），得出均数±标准差为14.78±0.46 mm。根据细菌对药物敏感性的判断标准，可知S.mutans对马尾连的敏感性为中度敏感，揭示马尾连对S.mutans具有较强的体外抑菌活性。

　　2.2马尾连对S.mutans的MIC和MBC

　　由实验结果（见图2）可知，马尾连的质量浓度≥7.81 mg/mL（1～5号管）时，管内液体澄清、透明且无细菌生长；马尾连浓度<7.81 mg/mL（6～8号管）时，管内液体浑浊、有细菌生长；9号管为阴性对照组，可见液体浑浊，有细菌生长；10号管为空白对照组，液体澄清、透亮。综上，马尾连对S.mutans的MIC为7.81 mg/mL，进一步说明马尾连具有良好的抑菌效果。

　　MBC实验结果显示，当马尾连质量浓度为125、62.5和31.25 mg/mL时，TSA平板上均无细菌生长；马尾连质量浓度<31.25 mg/mL时，TSA平板上的菌落>5 CFU/mL。结果表明，马尾连对S.mutans的MBC为31.25 mg/mL（>4 MIC），提示马尾连对S.mutans具有较强抑菌作用，且在高浓度作用下展现出显著的杀菌能力。

　　2.3马尾连对S.mutans的黏附作用

　　马尾连对S.mutans的黏附作用结果（以黏附抑制率表示）如表1所示。随着马尾连质量浓度升高，OD值逐渐降低，细菌黏附抑制率升高。当马尾连质量浓度≥1.95 mg/mL时，各组药液对S.mutans的黏附作用显著增强，抑制率由36.11%（药液质量浓度为1.95 mg/mL）提高至66.66%（药液质量浓度为7.81 mg/mL），与对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，马尾连通过抑制S.mutans的黏附作用发挥抗菌活性。

　　2.4马尾连对S.mutans的产酸作用

　　马尾连对S.mutans的产酸作用结果（以ΔpH表示）如表1所示。随着马尾连质量浓度升高，ΔpH逐渐降低。当马尾连质量浓度≥0.98 mg/mL，对S.mutans的产酸抑制作用随着浓度升高而增强，具有明显的浓度依赖性，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结果进一步表明，马尾连可通过抑制S.mutans的产酸作用发挥抗菌活性。

　　2.5马尾连对S.mutans生物膜形成量的影响

　　经比较分析，各实验组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01），如表2所示。当马尾连质量浓度≥1.95 mg/mL时，随着马尾连质量浓度升高，OD值逐渐降低，同时生物膜形成抑制率由34.04%显著提升至68.08%，表明马尾连能有效干扰S.mutans生物膜形成过程，且其抑制作用与药物浓度呈正相关（P<0.01）。

　　3结语

　　本研究系统评估了马尾连对S.mutans的体外抑菌活性。结果显示，马尾连对S.mutans的黏附、产酸和生物膜形成量表现出显著的抗菌作用，其抑菌圈大小为14.78±0.46 mm，MIC和MBC分别为7.81 mg/mL和31.25 mg/mL，揭示马尾连对S.mutans具有较好的抗菌优势，有望成为口腔领域抗菌药物研究的重要选择。已有研究[9]表明，中药的抗菌作用主要与黄酮类、多糖类、有机酸、生物碱类等化合物有关。马尾连是一种有效的抗菌中药，后续研究将从多糖类、黄酮类等活性成分入手，深入研究马尾连中的抗菌活性成分及抗菌机制，为抗龋药物研究提供新思路。

参考文献

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　　［2］林逢春,路则宝,李燕琼,等.3种特色中药材体外抑菌作用研究［J］.安徽农业科学,2013,41(34):13192-13193.

　　［3］周庭银,章强强.临床微生物学诊断与图解上（第4版）［M］.上海:上海科学技术出版社,2017.

　　［4］周颖,刘维平,王弘浩,等.3种中草药水提物及其复配剂的体外抑菌效果研究［J］.饲料研究,2024,47(6):90-94.

　　［5］朱晓萍,庄智威,崔英杰,等.不同酸化剂对常见致病菌的体外抑菌效果研究［J］.安徽农业科学,2020,48(4):78-80.

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　　［8］曹婷婷.大蒜素对变异链球菌的体外抑菌效果研究［D］.合肥:安徽医科大学,2019.

　　［9］朴喜航,艾红佳.中药抗菌成分及其抗菌机制的研究进展［J］.吉林医药学院学报,2017,38(6):445-447.